P-选择素在糖尿病中的研究进展＊

顾慧群综述 王伟灵审校

P-选择素在糖尿病中的研究进展＊

顾慧群综述 王伟灵审校

本文2011—02—28收到，2011—03—11修回，2010—03—18接受

细胞黏附分子选择素家族的重要成员P-选择素（P-se-lectin），储存于静止血小板的α颗粒和血管内皮细胞棒管状小体内。当血栓形成或炎症刺激致血小板活化时，其颗粒膜与胞质膜融合，通过胞吐作用，P-选择素迅速暴露于血小板和内皮细胞表面，在炎症反应和血栓形成初期起主要作用。高血糖是糖尿病微血管病变的病理学基础之一。高血糖引起血红蛋白糖基化，使组织缺氧和脂肪代谢紊乱，导致内皮细胞损伤和血小板活化，使P—选择素表达增加。P-选择素水平检测作为糖尿病患者血栓形成风险预测因子，在临床防治过程中起到一定的作用，因而得到较多应用。本文就P-选择素的结构、生物学效应和实验室检测以及在糖尿病、糖尿病心脏病中的作用作一综述。

1 P-选择素的生物学效应

1.1 P-选择素的结构及作用

P-选择素又称α颗粒膜蛋白140，依赖血小板激活的颗粒外膜即CD62p，是高度糖基化的单链跨膜糖蛋白。其结构特点是氨基端有约120个氨基酸的凝集素样区，以及约40个氨基酸的表皮生长因子（EGF）样区和九个相似的补体调节蛋白（Complement Regulatory Protein，CRP）串联重复序列。P-选择素的凝集素样区，可识别配基中唾液酸化的氨基多糖结构Lewisx，表达唾液酸化的Lewisx的细胞均可以与P—选择素结合。因此测定血浆P-选择素浓度可以评估体内血小板活化及内皮损伤程度［1］。

P-选择素属于选择素家族，在人和小鼠位于1号染色体，组成一个基因决定簇。选择素主要包括P—选择素、E-选择素、L-选择素，由胞外区的凝集素、表皮生长因子、CRP重复序列以及跨膜区与胞质区组成，P、E、L-选择素是根据CRP重复序列的不同进行分类的。新合成的P-选择素首先储存在Weibel-Palade小体，在炎症介质如组胺、凝血酶等刺激下，通过胞质膜融合释放，形成P-选择素在细胞表面的再分配。高表达的P-选择素可通过P-选择素糖蛋白配体l（PSGL-1）介导血小板、内皮细胞及白细胞间的细胞初始黏附以及白细胞沿血管壁内皮滚动，启动和促进血栓形成及局部白细胞黏附聚集［2，3］。

P—选择素可以直接兴奋中性粒细胞，也可增强血小板活化因子（PAF）和其它激动剂兴奋中性粒细胞的能力，如将外周血中性粒细胞和单核细胞与血小板共孵育可产生超氧负离子，超氧负离子的产生量依赖于共孵育的时间和血小板浓度；激活的血小板增强白细胞超氧负离子的作用可以被P—选择素抗体、抗Sialyl-1ewisx抗体或可溶性重组P—选择素融合蛋白抑制［4］。

P-选择素可以促进白细胞的游走［3］。白细胞上有P-选择素最重要的配体PSGL-l，PSGL-1是一个同型二聚体，每个亚基的分子量为120 k D，表达在各种类型的白细胞上。P—选择素与PSGL-1相互作用，形成血小板—白细胞聚集体，后者对血液凝固和炎症过程起非常重要的作用。

P-选择素还可以调节血小板的游走和CD40L（肿瘤坏死因子家族成员）的表达。血小板CD40L的表达增加及血浆可溶性CD40L受体升高都具有促血栓形成作用，CD40L与细胞膜上的CD40L受体结合可促进炎症细胞因子、白介素（IL-2、IL-8）、单核细胞趋化蛋白、组织因子（TF）的合成增加，并且上调黏附因子的表达［6］，从而促进在动脉粥样硬化的发展，是心血管事件的危险因素。

P-选择素还可以稳定血小板聚集物，并且决定血小板聚集物的体积，在止血和血栓形成中起到非常重要的作用［7］。

1.2 P-选择素的检测

1.2.1 ELLSA：P-选择素有两种变型，即可溶性 P—选择素和膜P-选择素。可溶性P-选择素在血液中以单体的形式存在于血浆或血清中。检测标本宜置于—80℃保存，避免反复冻融。采用酶联免疫吸附试验双抗体夹心ABC-ELlSA法测定，即用纯化的人P-选择素抗体包被微孔板，制成固相抗体，与待测标本中的P-选择素结合，再与HRP标记的P-选择素抗体结合，形成抗体—抗原—酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色，TMB在HRP的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样品中的P—选择素浓度呈正相关。用酶标仪测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品P-选择素浓度。

1.2.2 流式细胞术（FCM）：利用流式细胞术检测血小板膜上P-选择素的含量是公认的判定血小板活化状态的 “金标准”［8］。流式细胞术检测血小板膜上活化标记物P-选择素（CD62p）的优点为：直接应用全血检测，可反映血小板生理状态下的功能，同时简化了标本的处理，最大限度地减少了人为活化血小板，避免了因离心导致的血小板体外激活，并防止血小板亚群的丢失；且标本用量少，尤其适用于儿童和血小板减少症患者；还能检测出少到1%的活化血小板亚群及单个或亚群血小板膜活化标志物。其不足之处是价格较昂贵，操作复杂。

1.2.3 时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）：其原理是将三价稀土离子（如Eu3＋）作为示踪物，通过这些稀土离子与具有双功能结构的螯合剂以及抗原形成稀土离子—螯合剂—抗原螯合物。当标记抗原、待测抗原共同竞争抗体，形成免疫复合物时，利用时间分辨荧光分析仪，即可测定复合物中稀土离子发射的荧光强度，从而确定待测抗原的量。TRF1A克服了放射性免疫分析法（RIA）中放射性同位素带来的污染问题，也克服了酶免疫分析法（EIA）中酶的不稳定性缺点，并且能够很好的消除背景荧光的干扰，使其灵敏度比普通荧光法（FIA）高出几个数量级。

朱莹莹等［9］对以上3种方法进行比较后发现，用FCM、ELISA及TRFIA的结果是相联系的、一致的。ELISA仪器价格便宜，适合在基层单位应用；TRFIA的灵敏度高，操作方便，但仪器价格较贵；FCM用血量少，勿需分离血浆，检测速度快，只是批间差异较大，仪器价格较贵。以上3种方法尚需进一步标准化。

2 P-选择素在糖尿病中的作用

糖尿病患者微血管病变和大、中血管病变的发生率较高。微血管病变主要是视网膜眼底病变、肾脏病变、肢体末端坏疽等。大、中血管病变主要为动脉粥样硬化，多累及心、脑血管，引起冠心病和脑血管意外。长期高血糖引起血红蛋白的糖基化，使组织缺氧和脂肪代谢紊乱，导致内皮细胞损伤和血小板活化，增加血小板P-选择素表达，促进血小板聚集。

2.1 P-选择素与糖尿病微血管病变

长期高血糖可导致糖尿病患者内皮细胞高度表达P—选择素及增强白细胞黏附，而胰岛素能明显抑制P—选择素表达及其介导的白细胞黏附，因此推测糖尿病微血管病变与P-选择素介导的细胞黏附、血栓形成及促进炎症有关［10］。研究发现，糖尿病患者的血小板活化在无肾脏微血管病变时已经存在，只不过在发生了肾脏微血管病变后血小板活化更加明显，且释放出大量P—选择素，参与微血管病变的过程，而不是微血管病变的结果［11］。

糖尿病视网膜病变与微血管的损害和毛细血管堵塞有关，血小板以及单核细胞、巨噬细胞、粒细胞可能参与堵塞毛细血管，因在糖尿病患者的视网膜和肾脏的毛细血管中发现有血小板聚集物和血栓形成；近年研究发现糖尿病患者视网膜血管中可溶性P-选择素水平增加［12］。

糖尿病肾病（DN）是糖尿病严重的微血管并发症，也是糖尿病患者的重要死亡原因之一。王锋等［10］研究发现，糖尿病患者血浆P—选择素的水平高于正常组，而DN患者的P—选择素水平明显高于无并发症的糖尿病患者，表明P—选择素水平对判断DN的发生和发展有一定价值。Omoto等［13］研究也证明，DN外周血P—选择素阳性者，血小板数量比正常对照组及无并发症糖尿病组明显升高，在给予抗血小板药物后，P-选择素阳性患者的血小板计数水平显著下降。此外Hirata等［14］发现，DN患者肾组织中P-选择素沿着肾小球、间质毛细血管分布，与其它肾病（如微小病变性肾病、Ig A肾病及狼疮性肾炎等）相比，其表达显著增加。表明P-选择素的高度表达与肾小球硬化、间质纤维化有密切关系。近年来的临床研究对P-选择素在DN中所起到的致病作用给予了充分的认可，抗血小板药物在体内外实验中能有效抑制（如高糖等诱导）P-选择素的高度表达，并且发现抗凝治疗DN的新方法。这些研究成果将为进一步阐明DN与P—选择素的关系及临床治疗提供了良好的思路与基础［15］。

P—选择素还可能成为糖尿病微血管病变的早期预测指标［16］。高血糖使红细胞膜变硬、血粘度增高，导致局部血流停滞，循环受阻，引起糖尿病患者肢体末端的微血管病变，形成糖尿病足坏疽。P-选择素在糖尿病足坏疽患者中的高表达，有利于血栓风险的预测及抗血栓治疗。

2.2 P-选择素与糖尿病心脏病的关系

研究［17］表明，高血糖可刺激内皮细胞表达P-选择素及心肌细胞分泌单核趋化蛋白-1（MCP-1），后者诱导单核巨噬细胞通过PSGL-1与内皮细胞表面的P-选择素以配体—受体模式相互作用，最终透过内皮形成泡沫细胞。糖尿病心脏病时P-选择素和MCP-1之间亦可能相互促进表达，从而趋化单核巨噬细胞至心肌细胞间质及使心肌细胞间质等细胞外基质沉积增多，而 MCP-l可使心肌胶原蛋白I表达增多，心肌纤维增粗，心肌僵硬度增加［18］，从而共同参与糖尿病心脏病的发病。长期高血糖毒性作用能诱导P—选择素表达增多，导致血浆和组织蛋白质非酶糖基化，形成晚期糖基化终末产物，心肌中较多糖蛋白和晚期糖基化终末产物的形成和沉积，可导致心肌收缩功能和顺应性减低，影响和损害组织或脏器功能。研究［19］证明，心脏舒张功能受损程度与P-选择素浓度有关。

2.3 P-选择素与糖尿病脑血管并发症

在糖尿病合并脑血管并发症时，P-选择素在血浆中的表达也是增加的。有研究发现2型糖尿病合并脑血管并发症血小板P—选择素表达与2型糖尿病无血管并发症和正常对照相比显著增加。

3 结 语

临床分析表明，糖尿病、高血压、高脂血症患者，甚至健康吸烟者，其体内P—选择素水平明显高于正常人群［20］。与其它血小板标志物比较，P-选择素可以更灵敏地反映血小板活性。P-选择素一方面可以作为活化血小板的标志物，反映血栓前状态，提示血栓形成倾向；同时也是抗血小板治疗抑制血小板活化、减轻患者高凝状态、改善糖尿病并发症的有效监测指标之一。另一方面，P-选择素本身也是一个重要的导致血栓形成的致病因素；而针对P—选择素靶标的抗血栓、抗黏附治疗，可能会成为抗血栓形成的有效防治手段。所以，对P—选择素生物学效应及其与糖尿病、DN、糖尿病心脏病、糖尿病脑血管并发症等的关系和机制的深入认识和研究，有助于糖尿病患者血栓事件的预防，同时也为抗血小板药物的应用和研发提供理论依据。

本文作者简介：

顾慧群（1978～），女，汉族，医学学士，主管技师，主要从事止血与血栓检验工作

1 Aref S，Sakrana M，Hafez AA，et al.Soluble P-selectin levels in diabetes mellitus patients with coronary artery disease.Hematolo-gy，2005，10（3）：183～187.

2 陈誉华.医学细胞生物学，第4版.北京：人民卫生出版社，2008：233-235.

3 Norman KE，Katopodis AG，Thoma G，et a1.P-selectin glycopro-tein ligand-1 supports rolling on E and P-selectin in vivo.Blood，2000，96（10）：3 585～3 591.

4 Dole VS，Bergmeier W，Mitchell HA，et al.Activated platelets in-duce Weibel-Palade-body secretion and leukocyte rolling in vivo：role of P-selectin.Blood，2005，106（7）：2 334～2 339.

5 Kalsch T，Elmas E，Nguyen XD，et a1.Endotoxin-induced effects on platelets and monocyt-es in an in vivo model of inflammation.Basic Res Cardiol，2007，102（5）：460～466.

6 Geng JG，Chen M，Chou KC.P-selectin cell adhesion molecule in inflammation，thrombosis，cancer growth and metastasis.Curr Med Chem，2004，11（16）：2 153～2 160.

7 Bavbek N，Kargili A，Kaftan O，et al.Elevated concentrations of soluble adhesion molec-ules and large platelets in diabetic pa-tients：are they markers of vascular disease and diabetic nephropa-thy？Clin Appl Thromb Hemost，2007，13（4）：391～397.

8 Alexandre LG，Garrett P，Norma S，et al.Inhibition of platelet GPⅡb／IIIa and P-selectin expression by aspirin is impaired by stress hyperglyeemia.Jonr of Diab and its Compli，2008，23（1）：65.

9 朱莹莹，何 杨，张于娟，等.检测P-选择素3种方法的比较及临床应用，苏州医学院学报，2001，21（6）：653～654.

10 王 锋，汪年松，喻 明，等.P-选择素与糖尿病肾病，中华糖尿病杂志，2005，13（5）：396～397.

11 石永兵，董吉祥，施晓松，等.粘附分子P-选择素在糖尿病肾病中表达的临床意义，苏州大学学报，2002，2（1）：47～48.

12 Ogata N，Nomura S，Shouzu A，et al.Elevation of monocyted-erived microparticles in pati-ents with diabetic retinopathy.Dia-betes Res Clin Pract，2006，73（3）：241～248.

13 Omoto S，Nomura S，Shouzu A，et al.Signifieance of platelet-de-rived microparticles and activated platelets in diabetic nephropa-thy.Nephron，1999，81（3）：271～277.

14 Montrose-Rafizadeh C，Avdonin P，Garant MJ，et al.Pancreatic glucagons-like peptide-1 receptor couples to multiple G proteins and activates mitogen-activated protein kinase pathways in Chincse hamster ovary cells.Endocrinology，1999，140（3）：1 132～1 140.

15 张晓艳，张 银，史国辉，等.P-选择素与糖尿病肾病，华北煤炭医学院学报，2010，12（1）：47～49.

16 侯宇雁.P-选择素与糖尿病肾病，山西医药杂志，2009，38（6）：57～60.

17 Kum WW，Lee S，Grassl GA，et al.Lack of functional P-Selectin ligand exacerbates Salm-onella serovar typhimurium infection.J Immunol，2009，182（10）：6 550～6 561.

18 解 辉，潘晓黎，吴 伟.糖尿病心肌病心肌细胞纤维化的病理改变.中华老年心脑血管病杂志，2008，10（5）：374～376.

19 Graciano AL，Bryant DD，White DJ，et al.Targeted disruption of ICAM-1，P-selectin gen-es improves cardiac function and survival in TNF-alpha transgenic mice.Heart Circ Physiol，2001，280（4）：1 464～1 471.

20 Verhaar MC，Beutler JJ，Gaillard CA，et al.Progressive vascular damage in hypertension is associated with increased levels of cir-culating P-selectin.J Hypenens，1998，16（1）：45～50.

R587.1

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