不同提取方法对海燕皂苷抗氧化活性的影响

李敏晶,韩艳玲,谭成玉,刘远

(1.大连海洋大学海洋环境工程学院,辽宁大连116023;2.大连海洋大学辽宁省高校近岸海洋环境科学与技术重点实验室,辽宁大连116023)

不同提取方法对海燕皂苷抗氧化活性的影响

李敏晶1、2,韩艳玲1,谭成玉1、2,刘远1、2

(1.大连海洋大学海洋环境工程学院,辽宁大连116023;2.大连海洋大学辽宁省高校近岸海洋环境科学与技术重点实验室,辽宁大连116023)

采用微波辅助萃取法、超声波辅助萃取法和索氏萃取法分别提取海燕Asterina pectinifera总皂苷,用大孔树脂柱层析法对总皂苷进行分离提纯,并将分离提纯后得到的海燕皂苷样品与分离前的总皂苷样品的抗氧化活性进行了测定。结果表明:用不同提取方法所得的海燕皂苷在分离前后抗氧化活性不同,分离纯化后的皂苷样品抗氧化活性较好;3种提取法中用微波辅助萃取法所得海燕皂苷样品的抗氧化活性最好。

海燕;皂苷;微波辅助萃取法;超声波辅助萃取法;索氏萃取法

海燕Asterina pectinifera是中国黄海沿海十分常见的棘皮动物。海燕体呈五星型,反口面隆起为蓝紫色,其间镶有红色斑纹,生活时口面为橘黄色,其资源十分丰富[1]。海星纲海燕科动物含有大量结构独特的具有生物活性的代谢产物,如皂苷、生物碱、甾醇、多糖、维生素、蛋白质、多肽和氨基酸等,它们具有多种多样的生理和药理活性,如抗癌、抑菌、抗病毒、抗炎、降血压和降血脂等,因此,其在医药、保健食品及动物饲料资源开发等领域中有着巨大的应用前景[2]。海燕皂苷与植物皂苷一样均属于极性较大的分子,易溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂,不易溶于氯仿、乙醚等非极性溶剂。目前,关于海燕皂苷类化合物的提取方法很多[3-6]。本试验中,作者采用微波辅助萃取法、超声波辅助萃取法和索氏萃取法分别提取海燕Asterina pectinifera总皂苷,用大孔树脂柱层析法对总皂苷进行分离提纯,并将分离提纯后得到的海燕皂苷样品与分离前的总皂苷样品的抗氧化活性进行了测定,以期为海燕皂苷的药物开发提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

试验用海燕采自大连黑石礁海域。

试验仪器主要有:紫外-可见分光光度计(OPTIZEN2620UV型)、可见分光光度计(721型)、电热恒温水浴锅(SY2-4型)、真空干燥箱(DZF-6020型)、冷冻干燥机(ChristAlpha1-2型)、数显酸度计(PHS-25C型)、旋转蒸发仪(RE-52CS型)、电子天平(ALC-1104型)、溶剂过滤器(B-50型)。

二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)、维生素C (Sigma公司)、邻苯三酚等试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 海燕皂苷的制备 分别采用微波辅助萃取法、超声波辅助萃取法和索氏萃取法对海燕样品中总皂苷进行提取(以乙醇为溶剂),将提取液浓缩后经冷冻干燥得到海燕总皂苷样品。

选用D-101型大孔树脂,以体积分数为70%的乙醇作为洗脱剂,分别将三种提取方法所得到的海燕总皂苷样品进行分离纯化,每种提取方法分别纯化得到两种不同的皂苷样品Ⅰ和Ⅱ。将所有的海燕皂苷样品进行编号,具体见表1。

表1 海燕皂苷样品编号Tab.1 The number of the tested samples

1.2.2 海燕皂苷对DPPH·的清除作用 取表1中所列9种海燕皂苷样品,分别配成浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的样品溶液,加入2 mL 0.2 μmol/L DPPH·溶液,摇匀,室温下避光反应30 min,在517 nm处测其吸光度Ai,同时测定2 mL 0.2 μmol/L DPPH·溶液与2 mL无水乙醇混合液的吸光度值Aj,以及未加样品液时2 mL无水乙醇加2 mL DPPH·溶液的吸光度值Ac,分别计算9种样品对DPPH·清除率。计算公式如下:

1.2.3 清除DPPH·的反应动力学研究 将2 mL不同浓度的1、2、3号皂苷样品与2 mL DPPH·标准液反应,每间隔5 min记录1次A值,连续30 min,测定不同反应时间下的吸光度。以时间为横坐标、吸光度为纵坐标,绘制不同浓度的样品与DPPH·反应随时间推移的动力学关系曲线图。

1.2.5 海燕皂苷对·OH自由基的清除作用 在试管中加入1.0 mL 7.5 mmol/L的邻二氮菲水溶液、2.0 mL pH为7.4的磷酸盐缓冲液和1.0 mL 7.5 mmol/L的FeSO4水溶液,然后再分别加入1.0 mL体积分数为0.1%的H2O2水溶液(损伤管s)、1.0 mL体积分数为0.1%的H2O2水溶液和1.0 mL浓度为0.8 mg/mL海燕皂苷水溶液(样品管y)、1.0 mL体积分数为0.1%H2O2水溶液和1.0 mL浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的Vc水溶液(参照管c),以不加H2O2和样品液的作为空白管(k);各管均用蒸馏水定容至10 mL,摇匀,于37℃下反应1 h,以pH为7.4的磷酸盐缓冲液2.0 mL和8.0 mL双蒸水混匀作为空白参照管,于536 nm波长下测定各管液体的吸光度,按下式计算清除率:

2 结果与分析

2.1 海燕总皂苷、皂苷Ⅰ、皂苷Ⅱ对DPPH·的清除率

将海燕总皂苷、皂苷Ⅰ、皂苷Ⅱ对DPPH·的清除率结果绘制成图1。由图1可知,采用3种提取方法所得的海燕总皂苷、皂苷Ⅰ、皂苷Ⅱ样品对DPPH·均有一定的清除作用,且随着海燕总皂苷、皂苷Ⅰ、皂苷Ⅱ浓度的增加,其对DPPH·的清除率增大。可见提取样品的抗氧化活性与海燕总皂苷、皂苷Ⅰ、皂苷Ⅱ的浓度均呈量效关系。其中,用微波辅助萃取法提取的海燕总皂苷、皂苷Ⅰ、皂苷Ⅱ样品的抗氧化能力最强,用索氏萃取法提取的样品次之,而采用超声波辅助萃取法提取的样品最弱。这说明海燕皂苷抗氧化活性的强弱与其提取方法有一定的关系。本研究中,采用微波辅助萃取法对于皂苷抗氧化活性保持的效果最好。其原因可能是,采用微波萃取法可避免样品长时间或在过高的温压下分子结构被分解和破坏,因此对于皂苷样品的抗氧化活性保持的效果最好。

2.2 清除DPPH·的反应动力学的研究

将微波辅助萃取法所得总皂苷(1号)、皂苷Ⅰ(2号)、皂苷Ⅱ(3号)3种海燕皂苷样品与DPPH·自由基反应随时间推移的动力学关系分别绘制成图2。由图2可知,1、2、3号皂苷样品均随着时间的延长吸光度值逐渐降低,样品浓度越高其吸光值降低也越快。此规律说明:3种皂苷样品均具有明显的清除DPPH·自由基的效果;皂苷的含量越高,清除自由基的能力越强。

另外,将反应20 min的3种皂苷样品清除DPPH·的吸光度值绘制成图3。由图3可知,分离前的总皂苷样品和分离后的皂苷样品Ⅰ、Ⅱ,吸光度值大小在相同浓度下相差较大,说明分离后的皂苷样品Ⅰ、Ⅱ清除DPPH·的能力更强。而皂苷Ⅰ和皂苷Ⅱ两种样品对DPPH·的清除效率相差较小。

图1 海燕总皂苷、皂苷Ⅰ、皂苷Ⅱ对DPPH·的清除率Fig.1 DPPH·clearance by the total saponins,saponinsⅠ,and saponinsⅡbefore separation

图2 1、2、3号样品清除DPPH·的反应动力学曲线Fig.2 Kinetic curve of DPPH·clearance by sample saponins No.1,No.2,and No.3

图3 反应20 min时3种皂苷样品的吸光度Fig.3 Absorption of 3 saponin samples with reaction of 20 min

2.4 皂苷样品对·OH的清除率

由图5可知,海燕皂苷样品对·OH的清除率规律基本上与对·O的清除率结果一致。

图4 海燕皂苷样品对·O的清除率Fig.4 ·Oclearance by saponin samples

图5 海燕皂苷样品对·OH的清除率Fig.5 ·OH clearance by saponin samples

3 结论

1)采用微波辅助萃取法、超声波辅助萃取法和索氏萃取法提取的海燕皂苷9种样品均具有较为显著的抗氧化活性,且9种样品的抗氧化活性强弱与海燕皂苷的浓度大小呈量效关系。

2)海燕皂苷的抗氧化活性强弱与其提取方法有一定的关系。用微波法辅助萃取法得到的海燕皂苷样品抗氧化活性最强,其次是索氏萃取法,用超声波辅助萃取法得到的海燕皂苷样品抗氧化活性最弱。

3)本研究中涉及的9种海燕皂苷样品可分为三类,即海燕总皂苷样品、皂苷Ⅰ和皂苷Ⅱ。经提纯分离后的皂苷Ⅰ和皂苷Ⅱ的抗氧化活性显著优于分离前的海洋总皂苷样品的抗氧化活性。

[1] 任虹,迟安政,陈倩洁,等.海燕Asterina pectinifera生殖腺营养成分的研究[J].中国海洋药物,2002(6):32-34.

[2] 王洪欣,张立新.海星中皂苷类化学成分的研究进展[J].天然产物研究与开发,2005,17:96-103.

[3] Kicha A A,Ivanchina N V,Stonik V A.Seasonal variation in the levels of polyhydroxysteroids and related glycosides in the digestive tissues of the starfish Patiria(Asterina pectinifera)[J].Comparative Biochemisty and Physiology,2003,136:897-903.

[4] 文震,党志,宗敏华,等.超临界CO2萃取海星皂苷[J].精细化工,2006,23(7):657-660.

[5] 李敏晶,韩艳玲,周月,等.正交设计优化海燕总皂苷的微波提取工艺[J].广东化工,2010,37(7):19-20.

[6] 李敏晶,韩艳玲,刘远,等.超声波提取法对海燕总皂苷提取工艺的研究[J].广东化工,2010,37(8):69-70.

Effects of different extraction methods on antioxidant activity of asterosaponin in starfish Asterina pectinifera

LI Min-jing1,2,HAN Yan-ling1,TAN Cheng-yu1,2,LIU Yuan1,2
(1.School of Marine Environmental Engineering,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.Laboratory of Offshore Marine Environmental Science and Technology,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

Asterosaponin were extracted from starfish Asterina pectinifera by microwave-assisted extraction(MAE), ultrasonicwave-assisted extraction(UAE)and soxhlet extraction method,then isolated and purified by macroporous resin purification method.The antioxidant activity of each asterosaponin was analyzed.The results showed that the antioxidant activity of the asterosaponin was found to be varied with the extraction methods.The maximal antioxidant activity was observed in the purified asterosaponin extracted by MAE.

Asterina pectinifera;saponins;microwave-assisted extraction;ultrasonic wave-assisted extraction; soxhlet extraction method

O629.13

A

2095-1388(2011)04-0344-04

2010-10-13

辽宁省教育厅高等学校科研计划项目(2009A177)

李敏晶(1976-),女,博士,副教授。E-mail:minjingli@dlou.edu.cn