咖啡酸苯乙酯对糖尿病大鼠视网膜VEGF和ICAM-1表达的影响

袁 鹏 臧婵媛 周 伟 刘学政

糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病最具破坏性的眼部并发症，DR可对视力造成不可挽回的影响，早期预防和治疗DR成为研究者关注的热点。咖啡酸苯乙酯（CAPE）是一种从蜂胶中分离出的酚类物质，具有抗炎、抗氧化应激和免疫调节作用，为一种有效的特异性核因子（KF）-κB抑制剂[1]。糖尿病状况下，升高的炎性介质、活性氧化产物和糖基化终末产物可作为细胞外信号进一步激活NF-κB[2]。本实验旨在研究CAPE对糖尿病大鼠视网膜细胞间黏附因子（ICAM）-1和视网膜血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达的影响，以期观察CAPE在治疗DR中的药理作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料 雄性清洁级SD大鼠40只，体质量200～220 g，购自辽宁医学院实验动物中心，于温度为25℃、湿度为40%的动物房普通饲料喂养。链脲佐菌素（STZ）购自Sigma公司，CAPE购自美国IL公司，VEGF和ICAM-1酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒购自武汉博士德公司；One TouchⅡ血糖测定仪购自美国强生Lifescan公司，超声波细胞破碎仪（VCX105型，Sonics&materials公司），离心机（1-14型，Sigma公司），酶标仪（DNM-9606型，北京普朗新技术有限公司）。

1.2 模型制备与分组 大鼠禁食12 h后，按45 mg/kg尾静脉注射1%STZ溶液[0.1 mol/L的柠檬酸和柠檬酸钠缓冲液（pH 4.5）配制]；48 h后尾静脉采血测血糖，以后每月测1次，将血糖浓度大于16.7 mmol/L的大鼠定为糖尿病模型大鼠。取30只糖尿病模型大鼠随机分为3组，每组10只：DM组不使用任何药物，CAPE5组按5 mg/kg每3 d腹腔注射CAPE，CAPE10组按10 mg/kg每3 d腹腔注射CAPE，3个月后以上3组各剩下8、8、9只大鼠。另取10只SD大鼠，注射等剂量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液作为正常对照组（CON组）。

1.3 ELISA检测视网膜VEGF和ICAM-1蛋白水平 水合氯醛麻醉全部大鼠并断颈处死，迅速摘除大鼠双侧眼球（左眼用于VEGF蛋白水平测定，右眼用于ICAM-1蛋白水平测定），显微镜下，沿角膜巩膜缘切开眼球，去除晶体及玻璃体，剪碎视网膜，加入150 μL预冷的组织裂解液。裂解液组成：20%甘油，10 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton），300 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L二硫苏糖醇，0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟，20 mmol/L羟乙基哌嗪乙磺酸（pH 7.9）。视网膜在冰浴中超声粉碎2个循环，每个循环5 s，4℃下14 000 r/min离心15 min，取上清液2 μL使用BCA法进行蛋白定量，另取100 μL上清液按试剂盒说明书检测视网膜组织中的VEGF和ICAM-1水平。

1.4 统计学处理 采用SPSS 11.5软件进行分析，计量资料数据以±s表示，多组资料比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

4组大鼠视网膜VEGF和ICAM-1蛋白水平差异有统计学意义（均P＜0.01）。除CAPE5和CAPE10组间VEGF水平差异无统计学意义外（均P＞0.01），其他各组两两比较差异均有统计学意义（P＜0.001），见表1。

表1 4组大鼠视网膜VEGF及ICAM-1水平比较（μg/g，±s）

表1 4组大鼠视网膜VEGF及ICAM-1水平比较（μg/g，±s）

＊＊P＜0.01

CON（1）DM（2）CAPE5（3）CAPE10（4）F 10 889 0.85±0.11 2.43±0.17 1.45±0.19 1.41±0.22 125.05＊＊组比（1）∶（2）（2）∶（3）（3）∶（4）（2）∶（4）P＜0.001＜0.001 0.666＜0.001 3.71±0.15 7.97±0.26 5.69±0.32 4.43±0.19 564.84＊＊组比（1）∶（2）（2）∶（3）（3）∶（4）（2）∶（4）P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001统计学处理 统计学处理组别 n VEGF水平ICAM-1水平

3 讨论

许多炎性介质和细胞因子参与了DR的发生与发展，这些因子相互作用形成网状结构和相互关联的作用通路，共同影响DR的发生和发展，因此对这些细胞因子及其下游通路的抑制已成为治疗早期DR的重要方法。

Joussen等[3]研究表明DR与慢性炎症反应有诸多相似之处，ICAM-1介导的白细胞和视网膜毛细血管内皮细胞之间的黏附在DR的发生发展中起始动作用，白细胞黏附可引起视网膜毛细血管内皮细胞的凋亡、毛细血管无灌注的形成及血视网膜屏障的破坏，使用ICAM-1中和抗体可对DR起保护作用[4]。本研究结果表明，CAPE能明显抑制糖尿病大鼠视网膜ICAM-1蛋白的表达水平，从而抑制糖尿病大鼠早期视网膜病变。

VEGF是受NF-κB调控的促血管生长因子之一[5]，VEGF可通过诱导ICAM-1的表达引起炎症反应，是血视网膜屏障破坏和视网膜新生血管形成的主要调节因子，在DR的发生发展中起到重要作用。本研究结果表明，使用CAPE后糖尿病大鼠视网膜的VEGF蛋白表达水平得到了明显抑制，因此CAPE可通过抑制VEGF的蛋白表达水平对DR起保护作用。

活化的NF-κB可介导ICAM-1、白介素-1β、肿瘤坏死因子-α和环氧酶-2等与DR发生密切相关的细胞因子的表达，被视为糖尿病微血管病变的中心调控因子。作为一种有效的特异性NF-κB抑制剂，CAPE可能通过抑制糖尿病状况下升高的NF-κB的转录活性减少VEGF和ICAM-1的表达。同时CAPE还可能通过抑制TGF-β2信号转导通路间接对VEGF的表达进行调控[6]。CAPE对ICAM-1和VEGF蛋白表达水平的机制还有待深入研究，这也将为CAPE治疗DR提供进一步的理论依据。

[1]Natarajan K,Singh S,Burke TR Jr,et al.Caffeic acid phenethyl ester is a potent and specific inhibitor of activation of nuclear transcrip⁃tion factor NF-kappa B[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(17): 9090-9095.

[2]Kowluru RA,Odenbach S.Role of interleukin-1beta in the patho⁃genesis of diabeticretinopathy[J].Br J Ophthalmol,2004,88(10): 1343-1347.

[3]Joussen AM,Poulaki V,Le ML,et al.A central role for inflamma⁃tion in the pathogenesis of diabetic retinopathy[J].Faseb,2004,8(12): 1450-1452.

[4]Miyamoto K,Khosrof S,Bursell SE,et al.Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopa⁃thy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(19):10836-10841.

[5]Bian ZM,Elner SG,Elner VM.Regulation of VEGF mRNA expres⁃sion and protein secretion by TGF-beta2 in human retinal pigment epithelial cells[J].Exp Eye Res,2007,84(5):812-822.

[6]Fujioka S,Sclabas GM,Schmidt C,et al.Inhibition of constitutive NF-kappa B activity by I kappa B alpha M suppresses tumorigene⁃sis[J].Oncogene,2003,22(9)：1365-1370.