牦牛乳中DNA提取方法的建立与优化

崔艳华，马 莺，曲晓军，李海梅，何胜华

(1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，150090哈尔滨，maying@hit.edu.cn; 2.黑龙江省科学院微生物研究所，150010哈尔滨)

近年分子生物学技术已成为家畜育种及畜产品应用研究的有利工具.分离提取高质量的基因组DNA是家畜群体遗传变异、分子标记辅助选择育种、食品可溯性和基因工程等研究的基础.当前通常以动物组织和血液为材料，获得其基因组DNA［1-6］.收集上述样品技术操作上存在困难，而且均会对哺乳动物产生应激反应，影响产乳量［7］.牦牛是在高寒、缺氧等严峻自然条件下，经过长期自然选择和自身适应而形成的特殊牛种，主要分布在我国青海、四川、甘肃、新疆、云南等地的高原山区.牧民将牦牛视为神物，采取其组织或血液为实验材料，阻力很大，因此，寻找更为适宜的材料势在必行.

本研究采用常规离心方法从牦牛乳中分离体细胞，选用高盐法从体细胞中分离提取基因组DNA，并利用PCR检测对其进行评价.研究表明，该方法提取的基因组DNA可以用于PCR等后续研究.

1 试验

1.1 牦牛乳

牦牛乳取自四川麦洼牦牛.取样后，牦牛乳中加入叠氮化钠(NaN3，0.4 g/L)防止蛋白沉淀，存于-20℃.

1.2 试剂

蔗糖、Tris碱、盐酸、氯化镁、Triton-X-100、氯化钠、乙二胺四乙酸二钠盐、异丙醇、无水乙醇、乙二醇丁醚等均为分析纯，购自北京试剂公司.蛋白酶K、Taq酶及PCR相关试剂购自TAKARA公司.引物由上海生工合成.

1.3 主要仪器

高速冷冻离心机(Biofuge Stratos，Heraeus)、紫外可见分光光度计(TU-1800，北京普析通用仪器有限责任公司)、电泳仪(BioRad)、凝胶成像系统(BioRad)、PCR仪(TAKARA公司).

1.4 引物

根据牛κ-酪蛋白的第4外显子区域设计引物κ-CN F(5'-AGA AAT AAT ACC ATTCTGCAT-3')和κ-CN R(5'-GTTGAATTCTTTGATGTCTCCTTAGAGT-3')，预期产物片段大小为550 bp［8］.

1.5 牦牛乳中体细胞的提取

采用常规离心法提取牦牛乳中体细胞.收集50 mL牦牛乳，于4℃ 3 000 r/min离心15 min.离心后，牦牛乳分为3部分，上层为脂肪层，中间为脱脂乳，沉淀为体细胞.弃去脂肪和脱脂乳，用70%乙醇脱脂棉球心擦拭附在管壁上的乳脂.将沉淀重悬于5 mL PBS缓冲液(pH 7.4)中，在4℃下3 000 r/min离心10 min;去上清，将沉淀重悬于少量PBS缓冲液中备用［9］.

1.6 体细胞中DNA的提取

参见文献［10］方法，并在此基础上进行了修改.

1.6.1 体细胞的裂解

首先将体细胞重悬于 49 mL Lysis buffer (0.32 mol/L蔗糖，10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，5 mmol/L MgCl2，1%Triton-X-100);4℃下3 000 r/min离心10 min;将沉淀重悬于10 mL Wash buffer(0.075 mol/L NaCl，0.025 mol/L EDTA)中，洗涤2次;离心收集沉淀，将其重悬于3 mLTE溶液中(10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，2 mmol/L EDTA)，加入100 μL 10%SDS和40 μL蛋白酶K(10 g/L)，混匀，放于65℃水浴中1 h.

1.6.2 蛋白的去除

采用高盐法或酚/氯仿法去除蛋白.高盐法即温浴后，加入500 μL 5 mol/L NaCl，混匀，离心3 000 r/min 10 min去除沉淀蛋白.

酚/氯仿法则是在温浴后，冷却至室温，加入RNase，于37℃下作用20～30 min，去除RNA.加入与溶液等体积酚/氯仿(1∶1)，混匀后，12 000 r/min离心10 min;取上清，加入等体积的氯仿，再次抽提.

1.6.3 核酸沉淀

收集水相，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，-20℃下静置30 min;也可加入等体积的异丙醇或乙二醇丁醚，混匀，室温静置10～30 min. 12 000 r/min离心10 min;弃上清，沉淀于70%乙醇洗2次;沉淀于室温干燥，重悬于100 μL双蒸水.

1.7 DNA质量检测

1.7.1 琼脂糖电泳分析

DNA的完整性用1%非变性琼脂糖凝胶电泳，然后用凝胶成像系统观察.

1.7.2 DNA纯度鉴定

取提取的基因组DNA，用双蒸水稀释100倍，紫外分光光度计测量其在260和280 nm处的紫外吸光值).每个样品重复3次，取平均值.以OD260/OD280值进行纯度分析.

1.8 PCR

以提取的牦牛乳基因组DNA为模板，以κ-CN F和κ-CN R为引物扩增κ-酪蛋白的第4外显子区域.PCR反应程序为95℃4 min预变性，然后以94℃30 s、53℃30 s、72℃30 s为一个循环，共进行 30个循环，之后 72℃延伸10 min，4℃保存.PCR反应体系为:10×PCR buffer 5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)4 μL，上下游引物(10 μmol/L)2 μL，Taq酶 2 U，DNA 10～50 ng，用双蒸水补足体积至50 μL.

2 结果与分析

2.1 牦牛乳中提取基因组DNA方法研究

2.1.1 高盐法和酚/氯仿法的比较

去除蛋白的方法主要有酚/氯仿法和高盐法，其中酚/氯仿法较为常用.但是酚和氯仿等均为有机溶剂，尤其是氯仿具有刺激的挥发性气味，对人体有害.本研究采用SDS和蛋白酶K对体细胞进行破膜处理后获得细胞裂解液，将其均分为2份，分别采用高盐法和酚/氯仿法去除其中的蛋白质.两种处理均获得了基因组DNA，但是酚/氯仿方法因多次抽提，DNA损失较大，仅为高盐法的30%左右(见图1(a)).

利用紫外分光光度计测量OD260和OD280值，计算OD260/OD280值发现，酚/氯仿法和高盐法提取的DNA的OD260/OD280值均接近1.8，表明蛋白去除较为彻底.将两种方法获得的基因组DNA分别作为模板，扩增κ-酪蛋白的Ⅳ外显子区域，均可获得特异性PCR产物(见图1(b)).

天然状态的DNA、RNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)和核糖核蛋白(RNP)形式存在.DNP、RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同. DNP在低浓度盐溶液中几乎不溶解，随着盐浓度的增加溶解度也增加;RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，因此，采用高盐法去除蛋白的同时也去除了RNP，即去除了RNA.高盐法与酚/氯仿法相比操作简便快速，且省去了酚/氯仿抽提.

图1 不同去除蛋白方法对牦牛乳中DNA提取的影响

2.1.2 DNA沉淀试剂及沉淀时间的确定

提取核酸类物质DNA和RNA过程中，主要采用醇沉淀核酸，如无水乙醇和异丙醇.无水乙醇是首选的沉淀剂，对盐类沉淀少，可最大限度地降低盐浓度对后续实验的影响，并且容易挥发除去.但是需要量较大(通常为样品体积的2～3倍)，且需要在-20℃下放置较长时间(30～60 min).异丙醇沉淀核酸时，需要量小(通常0.6～1.0倍体积)且速度快，并能够在室温条件下进行，时间短，因此，适用于浓度低、体积大样品的沉淀.但缺点是异丙醇难以挥发除去，需要用70%的乙醇漂洗DNA沉淀数次.近年来，采用乙二醇丁醚提取核酸时，取得了较好的沉淀效果［11-12］.本研究对无水乙醇、异丙醇和乙二醇丁醚的沉淀效果进行了比较，由图2可以看出，异丙醇和无水乙醇的沉淀效果相近，而乙二醇丁醚效果最差，几乎无DNA.

图2 不同沉淀试剂对牦牛乳DNA提取的影响

2.2 牦牛乳不同贮藏条件下对基因组DNA提

取的影响

通常取样时需要备有专用设备对样品现场冷冻，以保证样品低温保藏.将同一牦牛乳样品保存在不同贮藏条件下，研究了贮藏条件对DNA提取质量的影响.

由图3可以看出，在4℃下保存3 d以及在-20℃下1～3 d的样品，提取的DNA较好;以上述样品提取的DNA为模板，PCR扩增κ-酪蛋白的Ⅳ外显子区域，均获得了约550 bp的目标条带.在-20℃下保存15～30 d的样品可提取DNA，但浓度有所降低，可用于PCR检测.在4℃下保存3 d的样品提取的DNA含量很低，条带非常微弱，通过加大DNA模板的体积可以用于PCR扩增.

图3 不同贮藏条件对牦牛乳中DNA分离提取的影响

在4℃下保存15 d的样品则几乎没有分离得到DNA.在30℃下保存的样品仅仅有微弱的条带.PCR扩增未得到目标条带.表明上述条件保存的样品不适宜于DNA的提取.

同时以保存在-20℃下达半年的牦牛乳样品为材料，提取了牦牛乳体细胞的DNA，发现可以获得DNA，并可用于PCR扩增.

3 结论

1)以牦牛乳为材料，建立以牦牛乳中体细胞提取牦牛基因组DNA的方法.并通过不同去除蛋白方法和DNA沉淀方法的比较，对该方法进行了优化.此方法取材容易，操作简便，避免了有机试剂抽提，且使用试剂价格低廉，适用于后续的PCR特异性扩增等操作.

2)通过不同贮藏条件对牦牛乳中DNA提取的影响研究发现，在4℃下短时间保存或在-20℃下长期保存，均可获得理想的DNA，应尽早处理材料，以期获得最佳的DNA.

3)本研究所建立的以牦牛乳为材料提取DNA的方法，避免了以牦牛组织或血液为实验材料的取样困难，为从分子水平上研究牦牛及牦牛乳提供了更为便捷有效的方法.

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