长期使用氯米帕明对大鼠睡眠/觉醒及食欲素的影响

李德恒 王兴红 张志国 樊红坤

睡眠紊乱是大多数抑郁症患者的症状之一。有资料提示，运动觉醒（动物觉醒且处于活动状态）调节缺陷以及由此可能产生的代偿性安静觉醒（动物觉醒且处于安静状态）增加，在抑郁症的发病中可能起着重要作用[1]。

食欲素（orexin）系统是睡眠、摄食、内分泌、消化、心血管活动调节有关的脑内神经递质系统。食欲素系统包括食欲素A、食欲素B和食欲素1、2受体 (OX1R，OX2R)。食欲素能神经元通过合成释放食欲素A增加安静觉醒，通过释放食欲素B增加运动觉醒。有研究发现，幼年使用氯米帕明处理的抑郁症大鼠模型多个脑区的食欲素B明显降低[2]。这些事实提示，抗抑郁治疗很有可能影响食欲素的分泌并相应地产生对觉醒与睡眠的调节。氯米帕明是一种三环类抗抑郁药，并有很强的抑制快速眼球运动睡眠的作用，治疗抑郁症大多需要长期服药。我们前期的研究显示短期使用氯米帕明可以减少运动觉醒而增加安静觉醒，并且影响食欲素的表达[3]。但是长期使用氯米帕明对睡眠及食欲素表达的影响仍是未知的。

1 材料与方法

1.1 实验材料

立体定位仪，日本Narishige公司；多导睡眠记录仪，美国Grass Instrument公司；低温高速离心机Avantim J-25型，德国Beckman公司；PCR扩增仪，德国Biometra公司生产；垂直电泳仪，Amersham Pharmacia Biotech公司；PE-480型凝胶图像分析仪，法国Vilber Lourmat公司。

氯米帕明，美国sigma公司；RNAiso Reagent，aq Enzyme，AMV，宝生物工程(大连)有限公司；引物: 美国Invitrogen公司。

β-actin 编号：NM031144，全长1296 bp，扩增片断427bp，序列5’-ATG AGG TAG TCT GTC AGG TC- 3’(650-631)；5’-GGT CAG AAG GAC TCC TAC GT-3’(223-242)。

Prepro-orexin 编号：AF041240，全长577bp，扩增片断479bp，序列5’-TGG CTT TTT GAA CAA CAA CAG ACA TCT -3’ (25-51)；5’-GGA CAG GGC CCG AAG AAC GAC TCA -3’ (504-481)。OX1R 编号：NM001525，全长1564bp，扩增片断188bp，序列5’-CCT TCC TGG CTG AAG TGA AG -3’ (998-1017)；5’-AGT GGG AGA AGG TGA AGC AG-3’ (1186-1167）。

OX2R 编号：NM001526，全长1843bp，扩增片断200bp，序列5’-ACA TGG CAC CAC TGT GTC TC-3’（1019-1200）；5’-TGG CTC GGA TCT GCT TTA TT-3’（1219-1200）。

1.2 实验方法

实验使用成年SD大鼠，雄性，体重（230±20）g（河南省实验动物中心提供）。生理盐水组8只；氯米帕明组8只。给药方式为腹腔注射CLI 20mg/kg ， 注射生理盐水0.1ml/20g。每12小时注射1次，共6周。于实验第5周实施多导睡眠描记电极安装手术。术后第6天开始睡眠描记。共描记96h睡眠/觉醒资料。描记期间动物自由摄取水和食物，并处于光暗周期(12h:12h)条件下。在描记结束后2h断头处死全部大鼠，取额叶皮层、海马和下丘脑，立即放置于液氮中，用于分子生物学检测。

1.3 RT-PCR

总RNA提取及RNA 反转录均按照试剂所明书进行。PCR按下列组份配置PCR反应液：TakaRa Taq 0.25μL，10×PCR Buffer(Mg2+free)，MgCl2。 dNTP Mixture 4，模板DNA 2.5ng，引物1(1μL)，引物2(2μL)。MgCl2浓度为Prepro-orexin 2.0mmol/L，OX1R 2.2mmol/L，OX2R 2.1mmmol/L。反应条件为Prepro-orexin，94℃3min，预变性，94℃30s ，59℃30s ，72℃40s，24个循环，72℃ 3min。OX1R 94 ℃3min，预变性，94℃30s ，56℃30s ，72℃40s，24个循环，72℃ 3min。OX2R94℃3min，预变性，94℃30s ，56℃30s ，72℃40s， 24个循环，72℃ 3min。β-actin 上述三条件都使用。产物凝胶电泳，凝胶照相，测定cpm值。

1.4 统计分析

使用SPSS16.0软件进行统计处理，睡眠/觉醒记录资料和分子生物学数据以均数±标准差（）表示。睡眠/觉醒资料处理使用单因素方差分析，分子生物学资料结果使用t-test检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 氯米帕明对睡眠/觉醒周期的影响

觉醒状态可以进一步分为运动觉醒和安静觉醒。结果显示和对照组相比氯米帕明注射，使得运动觉醒时间减少，安静觉醒时间增加，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。睡眠状态也可以进一步分为慢波睡眠和快速眼球运动睡眠。结果显示氯米帕明使得快速眼球运动睡眠时间减少（P＜0.01），慢波睡眠时间增加（P＜0.05），见表2。

表1 大鼠每日安静觉醒和运动觉醒的改变(min/D，)

表1 大鼠每日安静觉醒和运动觉醒的改变(min/D，)

注：与生理盐水组相比，*P＜0.01

表2 大鼠睡眠和觉醒时间的改变(min/D，)

表2 大鼠睡眠和觉醒时间的改变(min/D，)

注：与生理盐水组相比，*P＜0.05，** P＜0.01

组别 慢波睡眠时间 快速眼球运动睡眠时间生理盐水组 696.16±52.14 158.23±13.38氯米帕明组 758.51±12.21* 98.54±8.45**

2.2 氯米帕明对食欲素系统mRNA的影响

脑内食欲素前体mRNA在一定程度上反映了脑内食欲素A、B的水平。结果显示与对照组相比，注射氯米帕明使得额叶皮层、海马、下丘脑的食欲素前体mRNA减少，差异具有统计学意义(P＜0.01)，见表3。同时食欲素2受体mRNA减少，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，见表4。但是上述脑区的食欲素1受体mRNA无显著变化(P＞0.05)。

表3 食欲素前体mRNA的表达（%，）

表3 食欲素前体mRNA的表达（%，）

注：与生理盐水组相比， *P＜0.01

组别 额叶皮层cmp 海马cmp 下丘脑cmp生理盐水组 65.42±16.38 53.24±12.35 58.06±10.23氯米帕明组 18.05±6.03* 21.34±10.21* 13.25±3.28*

表4 食欲素2受体mRNA的表达（%，）

表4 食欲素2受体mRNA的表达（%，）

注：与生理盐水组相比，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 额叶皮层cmp 海马cmp 下丘脑cmp生理盐水组 63.54±31.02 50.23±7.36 72.56±22.31氯米帕明组 15.01±8.02* 14.98±8.23** 12.84±5.28**

3 讨论

3.1 氯米帕明对睡眠/觉醒周期的影响

氯米帕明是一种经典的三环类抗抑郁药。它的药理作用主要是抑制神经末梢对5-羟色胺和去甲肾上腺素的重摄取，从而延长了单胺类神经递质的作用时间。本实验发现，长期使用氯米帕明对快速眼球运动睡眠的抑制与相关文献的报道的结果是一致的[4]。关于氯米帕明抑制快眼动睡眠的机制尚无直接资料。有研究发现快速眼球运动睡眠的触发和维持取决于脑干被盖背外侧核和脑脚桥核的胆碱能神经元[5-6]。因此，氯米帕明对快速眼球运动睡眠的抑制机制可能是首先延长了5-羟色胺和去甲肾上腺素的作用后，通过5-羟色胺和去甲肾上腺素受体抑制了胆碱能神经元的活动导致的。同时目前没有证据证明氯米帕明对胆碱能系统有直接作用。

长期使用氯米帕明抑制运动觉醒，促进安静觉醒。这一结果与我们前期实验（短期使用氯米帕明）的结果是一致的[3]。氯米帕明对觉醒的影响是并不改变总觉醒时间。这一现象似乎不能以其对5-羟色胺和去甲肾上腺素重摄取的抑制来解释。因为这两种递质都具有增加觉醒的作用。这些事实表明有可能氯米帕明同时激活了另一觉醒抑制性机制，保护了总的睡眠与觉醒的平衡。而这一机制可能与食欲素神经元有关。

3.2 氯米帕明对食欲素系统三种mRNA 表达的影响

一系列证据表明食欲素和睡眠/觉醒调节有关[2，7]。本实验发现长期使用氯米帕明显著抑制了食欲素前体和食欲素2受体mRNA的表达，这种mRNA表达的抑制与氯米帕明所致的运动觉醒减少是一致的。然而，导致这种结果的详细机制尚无所知。现有资料提示两种可能：一种可能是，首先氯米帕明抑制了5-羟色胺和去甲肾上腺素的重摄取，延长了这些递质的作用后；接着5-羟色胺和去甲肾上腺素反馈性地抑制了食欲素能神经元或者食欲素前体的基因表达。但是这一解释却不能阐明氯米帕明对食欲素B受体mRNA的表达抑制。另一个可能是，氯米帕明对5-羟色胺和去甲肾上腺素重摄取的抑制作用模拟了运动觉醒的分子生物学变化，而这一变化可能对食欲素B受体mRNA的表达具有负反馈调节作用。支持这一学说的证据有5-羟色胺和食欲素B的释放均是在肌肉运动时最高，5-羟色胺受体激动剂抑制食欲素能神经元的活动[8]。尽管如此，对这一假说的支持需要更多的直接资料。

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