高原肺动脉高压大鼠重返平原后Caspase-3的表达

陈强 高芬

高原肺动脉高压（high altitude pulmonary hypertension,HAPH）是指生活在海拔2500m以上地区的人群，因对高原环境适应不全所致低氧性肺动脉高压（hypoxic pulmonary hypertension,HPH）及相关临床表现[1]。目前认为HPH的形成主要与低氧性肺血管收缩（hypoxic pulmonary vasoconstricyion,HPV）和肺血管重建(pulmonary vascular remodeling, PVR)有关。有研究提示，在大鼠肺动脉高压模型中，血管重建与凋亡密切相关[2-3]。我们通过测定高原肺动脉高压大鼠、重返平原大鼠及对照组大鼠的肺组织caspase-3表达，探讨重返平原对低氧性肺动脉高压的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物 雄性Wistar大鼠80只，体重180～220g,由甘肃中医学院实验动物中心提供。

1.2 试剂 caspase-3兔抗大鼠IgG(美国abcam公司)；过氧辣根山羊抗兔IgG(北京中杉金桥)；ECL显色液（美国Pierce公司）;Marker（美国Fermentas公司）；其余试剂为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 研究对象与分组

将80 大鼠随机分为高原组（10、20、30d）、重返平原组（10、20、30、90d）、正常对照组，每组10只。所有大鼠用相同食物喂养,将高原组与重返平原组置于青海大学医学院高原医学中心低压氧舱内,模仿海拔5000m高原低氧环境,进行22h/d低氧处理。于10、20和30d各取10只测定肺血流动力学指标与对照组比较，确定是否造模成功。30d后将高原低氧肺动脉高压大鼠带到海拔580m的陕西省咸阳市继续喂养。

1.3.2 肺组织取材及保存

0.5%乌拉坦腹腔注射麻醉后经颈动脉放血处死，无菌迅速取出心肺组织，用生理盐水冲洗干净。沿肺门将心肺组织分离，并迅速将肺组织剪成直径约5mm的小块放入液氮速冻，然后放入冻存管，转移至－80°冰箱保存。

1.3.3 Western blotting

（1）取肺组织约100mg，剪碎，加入0.5ml蛋白裂解液，手动匀浆至无组织块残留。(2)4℃离心，12000rpm，1min，取上清冰上孵育5min。(3)4℃离心，5000rpm，10min。取上清，即为蛋白提取液。(4)以BSA为标准品，用BCA法测蛋白浓度。(5)将样品煮沸5min后进行SDS-PAGE蛋白电泳。(6)电转至PVDF膜。（7）转膜后用5%脱脂奶粉室温下封闭2h，用1:2500的caspase-3单抗（4℃过夜），第II抗体为过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 1:5000,室温下孵育1h，最后用增强的化学发光试剂显色，观察结果。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 caspase-3蛋白质的表达

免疫印迹结果表明，高原组大鼠的caspase-3表达明显低于正常对照组和重返平原后大鼠的caspase-3表达，结果见表1和图1。

表1 各组大鼠caspase-3的表达（n=10，）

表1 各组大鼠caspase-3的表达（n=10，）

注：a P＜0.05 vs 对照组，b P ＜0.05 vs 高原20d，c P＜0.05 vs 高原30d，d P＜0.05 vs 对照组。

平原组10d 20d 30d 10d 20d 30d 90d 32.01±0.96 13.88±1.344 5.09±0.75a 6.07±0.90 6.89±0.81 10.53±0.43b 13.08±1.10c 22.30±0.43 d对照组 高原组

图1 各组大鼠caspase-3的表达

3 讨论

高原性肺动脉高压是指正常人移居高原后由于低压性缺氧，引起肺小动脉功能及器质性改变致使肺动脉压力增高。早期高原性肺动脉高压系因急性缺氧引起的肺小动脉收缩，长期慢性低氧则引起肺血管重构,最终发展为难治性梗阻性肺动脉高压[4]。目前,有关低氧性肺血管重建发病机制的研究重点主要在细胞的增殖面。虽然肺血管平滑肌细胞增殖在低氧性肺血管重建中起至关重要的作用,但血管壁的构成是由细胞增殖和细胞凋亡之间的平衡所决定的,所以二者之间的平衡失调更为重要[5]。

天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinases，Caspase）家族是参与肺血管平滑肌凋亡，抑制肺血管重构，阻止肺动脉高压形成的凋亡因子。凋亡分子caspase-3，可启动线粒体途径和死亡受体途径引起凋亡，是凋亡的最终执行者。我们发现，模拟高原20d后caspase-3的表达与正常对照组相比明显减少（P＜0.05），这与肖雅琼等[6]的实验结果是一致的。重返平原20、30d 后caspase-3的表达较高原20、30d有所恢复（P＜0.05）,但是与正常组比较其表达仍低（P＜0.05）。由此可见，重返平原后，肺动脉高压大鼠的凋亡机制逐步恢复，但未达到正常凋亡水平。可以推测，常氧常压可造成低氧性肺动脉高压大鼠肺血管平滑肌caspase-3表达上调，增加凋亡，可以有效缓解高原低氧性肺动脉高压。其具体作用机制及临床应用有待进一步的研究。

[1]Ge Ri-Li,Peter Hackett.Life on the Qinghai-Tibetan plateau[M].Beijing: Peking University Medical Press,2007:100-110.

[2]Cho A, Court man DW,Langille BL.Apotosis(programmed cell death)in arteries of the neonatal lamb[J].Circ Res, 1995, 76: 168-175.

[3]Tuder RM, Marecki JC, Richter A, et al.Pathology of pulmonaryhypertension[J].Clin Chest Med, 2007,28: 23-42.

[4]张新川，张世界.慢性高原心脏病的的资料分析[J].当代医学，2008,14（10）：88-89.

[5]钟晓宁，姚龙.肺血管重建在低氧性肺动脉高压中的作用及其机制[J].中国呼吸与危重监护杂志，2003（4）:246-248.

[6]肖雅琼，肖诗亮,等.Dichloroacetate与肺动脉平滑肌细胞增殖及凋亡关系的研究[J].华中科技大学学报,2007,36（4）:482-484.