iASPP真核表达载体的构建及其对NIH3T3细胞增殖的影响

孔凡铭，张新伟，于津浦，魏 枫，李 慧，任秀宝

（天津医科大学肿瘤医院免疫室，天津市肿瘤防治重点实验室，天津 300060）

p53凋亡刺激蛋白家族的抑制成员(inhibitory member of the ASPP family,iASPP)是最近发现的能特异性抑制p53抑癌功能的蛋白[1]，并在多种肿瘤细胞中存在过表达现象，且能抑制p53的促凋亡活性[1-6]，提示抑制iASPP的高表达可能成为恢复p53抑癌功能的新策略。本研究成功构建FLAG-pcDNA3.0-iASPP质粒，并初步验证该质粒能够正确编码FLAG-iASPP蛋白，促进NIH 3T3细胞增殖。

1 材料和方法

1.1 质粒及试剂 FLAG-pcDNA3.0载体系中国协和医科大学血研所王建祥教授惠赠；PCMV-iASPP克隆购自OriGene公司；大肠杆菌DH5α和NIH3T3细胞系由本室保存；引物合成、脂质体转染剂均为Invitrogen公司提供；限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB公司；小鼠iASPP单克隆抗体购自Sigma公司，山羊抗小鼠（HRP标记）抗体购自苏州拜吉氏生物科技有限公司；细胞培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)购自Gibco公司；胎牛血清（FBS）购自HyClone公司；DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；质粒抽提试剂盒购自TIANGEN公司；PCR试剂购自TAKARA公司。

1.2 方法

1.2.1 FLAG-pcDNA3.0-iASPP质粒的构建及鉴定

根据GenBank iASPP基因序列信息，设计并合成引物。引物正义链：5′-AGCTGAATTCCGCCACCATGGACAGCGAGGCATTC-3′，5′端加入EcoR I酶切位点；反义链：5′-TAGTCTCGAGCTAGACTTTACTCCTTTGAGGCTTCACC C-3′，5′端加入Xho I酶切位点，扩增产物约2713bp。以源克隆PCMV-iASPP为模板PCR扩增iASPP的CDS区，Eco R I与Xho I限制性内切酶消化真核表达载体FLAG-pcDNA3.0及切胶回收的PCR产物。再次纯化后，T4DNA连接酶16℃连接过夜，转化感受态大肠杆菌DH5α，37℃培养12h。挑取单个克隆进行过夜培养，提取质粒进行酶切和测序鉴定。其中测序工作委托上海Invitrogen公司完成。

1.2.2 基因转染及稳定表达细胞株的筛选 NIH3T3细胞培养至对数生长期时，收获细胞。以5×104/孔接种于6孔板中，孵育24h后进行转染，按Lipofectin Reagent试剂盒操作说明，将FLAG-pcDNA3.0-i ASPP和空载体FLAG-pcDNA3.0各4μg，分别转染NIH3T3细胞，转染6h后更换完全培养基，48h后1∶10传代并以500μg/mL G418筛选21～30d，所得阳性克隆继续培养，未转染的NIH3T3细胞作空白对照。

1.2.3 FLAG-pcDNA3.0-iASPP在NIH3T3细胞中的表达

1.2.3.1 RT-PCR检测基因表达：将筛选出的G418抗性克隆（转染空载体FLAG-pcDNA3.0、转染FLAG-pcDNA 3.0-iASPP的NIH3T3细胞）及未转染的NIH3T3细胞培养至对数生长期，用TRIzol试剂提取总RNA，设计上下游引物并行RT-PCR扩增鉴定。上游引物：5′-GTGAA GGAGATGAACGACCCG-3′，下游引物：5′-GGCGCAGTCAGCATAACCC-3′,扩增产物长度为297bp。PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸45s，共27个循环，最终72℃延伸10min。PCR反应产物经2%凝胶电泳检测。

1.2.3.2 Western blotting检测蛋白表达：细胞裂解液裂解上述对数生长期细胞，加4×SDS上样缓冲液，煮沸5min。各样品取等量，进行SDS-PAGE，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，按Western b1otting常规操作依次进行封闭、与抗iASPP单克隆抗体反应，洗涤后与HRP标记的山羊抗小鼠IgG反应，然后按照ECL试剂盒的操作说明进行发光反应。

1.2.4 MTT法检测 FLAG-pcDNA3.0-iASPP对NIH3T3细胞增殖的影响 将未转染的NIH3T3细胞、NIH3T3-F LAG-pcDNA3.0-iASPP细胞和NIH3T3-FLAG-pcDNA3.0细胞按每孔1×103个细胞传代于96孔板，各设6个复孔。24h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，37℃继续孵育4h，弃培养基，每孔加入DMSO150μL，振荡10min。在490nm波长的酶联免疫检测仪上测各组吸光度（OD）值，连续检测5d。以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

2 结果

2.1 重组质粒FLAG-pcDNA3.0-iASPP的酶切鉴定及序列测定 3个重组质粒FLAG-pcDNA3.0-i－ASPP样本经EcoR I和Xho I双酶切后，0.8%琼脂糖电泳可见2713bp的目的条带（图1），证明iASPP已经成功插入到FLAG-pcDNA3.0载体中。测序结果（略）经BLAST分析显示与Genbank中的序列(登录号：NM_006663.3)CDS区一致。

图1 重组质粒FLAG-pcDNA3.0-iASPP的双酶切鉴定Fig1The identification of recombinant plasmid FLAG-pcDNA3.0-iASPP by restriction enzyme digestion

2.2 iASPP在NIH3T3细胞中的表达

2.2.1 RT-PCR检测结果 转染细胞经G418持续筛选21d后形成明显阳性克隆，而未转染的细胞则全部死亡。将阳性克隆扩大培养后，采用RT-PCR方法检测转染细胞中iASPP mRNA的表达。结果显示：转染FLAG-pcDNA3.0-iASPP组的NIH3T3细胞在297bp处可见基因iASPP的目的条带，而未转染组及转染空质粒组则未见目的条带，表明外源iASPP可以很好转录（图2）。

2.2.2 Western blotting检测结果 Western blotting检测结果显示，在转染FLAG-pcDNA3.0-iASPP的NIH3T3细胞的阳性克隆中，可检测到相对分子质量为99kD的目的条带，而转染空质粒组及未转染组均未见iASPP蛋白表达（图3）。

2.3 MTT法检测FLAG-pcDNA3.0-iASPP对NIH3T3细胞增殖的影响 MTT比色法测定各实验组在490nm波长处的OD值，取均值绘制折线图（图4）。应用SPSS13.0软件单因素方差分析显示：转染Flag-pcDNA3.0-iASPP组增殖速率高于未转染组和转染空质粒组，且具有统计学差异，P值分别为0.036、0.022；而未转染组与转染空质粒组（FLAG-pcDNA3.0）增殖速率基本一致，两者无统计学差异（P=0.974）。

图2 RT-PCR鉴定结果Fig 2 Result of RT-PCR identification

图3 Western blotting检测结果Fig 3 Result of Western blotting identification

图4 MTT法测定不同转染组细胞增殖情况Fig 4 Cell proliferation were evaluated using MTT assays among different groups

3 讨论

p53凋亡刺激蛋白家族（apoptosis stimulating protein of p53，ASPP），是迄今为止发现的最完善、积极的调控p53的基因家族，由3个成员组成：ASPP1、ASPP2和iASPP。ASPP1、ASPP2是p53蛋白的活化子，能特异性的激活p53促凋亡活性，而不影响细胞周期阻滞[7]；iASPP则抑制p53的促凋亡活性，起到类似癌基因的作用，多项研究指出i－ASPP在乳腺癌、白血病、肺癌、垂体瘤、肝细胞癌中存在过表达现象[1,5-6,8]。阻断iASPP和p53的结合能够恢复p53的功能，提示iASPP有望作为肿瘤治疗靶点[9-13]。

通过iASPP基因siRNA质粒转染P53野生型白血病细胞株Nalm6和P53基因突变型白血病细胞株K562，发现iASPP mRNA、蛋白表达都有所降低，细胞生长和增殖受到明显抑制，同时细胞凋亡有所增加[8]。为进一步确认iASPP能否成为白血病治疗的一个靶点，联合化疗药物（柔红霉素和依托泊苷）对这两个白血病细胞株进行了实验，发现化疗药物并不影响iASPP mRNA的表达，但下调i－ASPP mRNA水平能显著增强化疗药物诱导的凋亡，这种趋势在Nalm6细胞株中表现得尤为明显。相似的一项研究亦发现转染iASPP基因siRNA质粒后iASPP mRNA表达有所降低，细胞凋亡有所增加，且细胞凋亡增加的程度与p53的状态有关[14]。

本研究采用PCR的方法从源克隆PCMV-i－ASPP中扩增获得iASPP基因编码区序列，并亚克隆到真核表达载体FLAG-pcDNA3.0中，经酶切、测序鉴定序列正确，转染细胞后可检测到iASPP基因mRNA和蛋白水平表达。iASPP真核表达载体的成功构建使得我们在一定程度上可以了解在iASPP过表达情况下，细胞生物学指标、功能的变化。与化疗药物联合，还可以分析肿瘤耐药的可能机制。另外，本研究亦通过用脂质体介导转染NIH3T3细胞，G418加压筛选后获得稳定表达iASPP的细胞系，MTT法比较其与未转染组和转染空质粒组的增殖情况，发现稳定表达iASPP细胞系的增殖率明显增高，初步验证了iASPP的促细胞增殖活性。

总之，iASPP真核表达载体的成功构建，是iASPP基因siRNA技术的一个重要补充，为进一步开展直接、全面的研究iASPP的生物学功能奠定了基础。我们今后的研究重点应在于探讨其在肿瘤发生中的具体作用机制，进一步分析其作为肿瘤治疗新靶点的可行性。

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