大孔吸附树脂对虎杖中虎杖苷的吸附分离效果的研究

赵愉快，刘仲华，莫卓群

（湖南农业大学，湖南 长沙 410128）

虎杖别名花斑竹（polygonum cuspidatum Sieb et Zucc），是蓼科属多年生草本植物，其干根、茎入药，性味苦寒[1]。虎杖苷是其有效成分之一，具有强心扩血管、抑制血小板聚集、调节血脂、镇咳平喘、祛风利湿、散瘀、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用[2-4]，在临床应用上有重要价值。笔者研究了大孔吸附树脂对虎杖苷的吸附和解吸特征及效果，旨在为简化虎杖苷分离工艺和提高收率提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药 材 虎杖药材（湖南美可达生物资源有限公司）。

1.1.2 试 剂 乙腈（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司）；甲醇、乙醇（分析纯）；水（蒸馏水）；D101、AB-8、HPD-100、HPD-500（安徽三星树脂科技有限公司）；虎杖苷（湖南美可达生物资源有限公司）。

1.1.3 仪器和设备 HH数显恒温水浴箱（金坛市金域国胜实验仪器厂）；DHG-9154A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；SK3300H超声波清洗仪（上海科岛超声仪器有限公司）；予华SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；ZK-82B型真空干燥箱（上海市实验仪器总厂）；AE-240电子天平（METTER TOLEDO公司）；800-1电动离心机（江苏金坛荣华仪器制造有限公司）；Waters 1525高效液相色谱仪、2487双通道紫外可见检测器、2707自动进样器。

1.2 实验方法

1.2.1 树脂的预处理 将新购买 D101、AB-8、HPD-100、HPD-500树脂分别用95%乙醇在室温下密封浸泡24 h，使其充分溶胀；湿法装柱；用2倍树脂体积的95%乙醇，以2 BV/h的流速通过树脂床[5]，直至流出的乙醇冲洗液与蒸馏水等量混合无混浊，并在紫外波长200～400 nm范围内；检测除了乙醇本身的吸收外无其它吸收为止，后备用。

1.2.2 虎杖苷的HPLC法测定 标准曲线的绘制。（1）精密称取虎杖苷64.8mg，分别于25mL棕色容量瓶中，80%甲醇溶液溶解并定容至刻度。分别取上述对照品溶液 1，2，4，6，8mL 于 25mL 棕色容量瓶中，用80%甲醇溶液定容至刻度，得5个不同浓度的对照品液。

（2）上样液的制备。称取1 g虎杖细粉，分别加入5、4、3倍量80%甲醇液，60℃，磁力搅拌提取3次，时间分别3、2、2 h，所得滤液混和，减压浓缩至40%醇过滤，滤液继续浓缩至无醇味，加等体积的蒸馏水超声过滤，滤液即为上样液。

（3）虎杖苷含量的测定。依利特色谱柱Hypersil ODS2C18（4.6×200 mm），流动相为乙腈∶水（23∶77）；柱温：25℃；流速为 1 mL/min；检测波长 303 nm；进样量为5μL。

1.2.3 虎杖苷静态吸附和解吸试验 分别称取D101、AB-8、HPD-100、HPD-500 经预处理后的大孔吸附树脂各2.00 g，置于100mL锥形瓶中，向瓶中加入25 mL上样液，室温下（25℃），摇床震荡吸附12 h，转速120 r/min。吸附平衡后，过滤出溶液，取上清液5μL测定虎杖苷的质量浓度。将吸附饱和树脂用蒸馏水洗至无色，置于100mL锥形瓶中，加入25mL 70%乙醇，连续震荡解吸12 h。测定解吸液中虎杖苷的质量浓度，计算出树脂的静态吸附量、解吸率。找出适合虎杖苷分离的吸附树脂。

静态吸附量（mg/g）=[（吸附前溶液中虎杖苷的浓度-吸附后溶液中虎杖苷的浓度）×溶液体积]/树脂总重量（g）

静态解吸率（%）=[解吸液虎杖苷量/（吸附前溶液中虎杖苷量-吸附后溶液中虎杖苷）]×100

1.2.4 虎杖苷动态吸附和洗脱试验 （1）上样液浓度的确定。称取已处理好的HPD-500型大孔吸附树脂6份，每份2.00 g，装入玻璃柱（φ1.2 cm×18 cm）中，吸取样液 6份，每份10 mL，分别加入 0、10、20、30、40、50mL 蒸馏水，制成虎杖苷浓度分别为 3.04、1.51、1.01、0.76、0.61、0.51 mg/mL 的 上 样液，混匀后上柱，以3 BV/h的流速通过玻璃柱，收集过柱液，检测虎杖苷含量。

（2）上柱液流速对吸附的影响。称取已处理好的HPD-500型大孔吸附树脂5份，每份2.00 g，装入玻璃柱（φ1.2 cm×18 cm）中，吸取样液5份，浓度为0.76 mg/mL，以不同流速通过玻璃柱，收集过柱液检测虎杖苷含量。考察 1、2、3、4、5 BV/h 的流速对树脂吸附率的影响。

（3）乙醇浓度对解吸的影响。称取已处理好的HPD-500型大孔吸附树脂4份，每份5.00 g，装入玻璃柱（φ1.2 cm×18 cm）中，吸取样液4份，浓度为0.76mg/mL，以流速为3 BV/h通过玻璃柱4BV柱体积水洗后，再用3 BV不同浓度乙醇2 BV/h洗柱，收集解吸液检测虎杖苷含量。考察30%、50%、70%、95%乙醇浓度对树脂解吸率的影响。

（4）洗脱剂流速对解吸的影响。称取已处理好的HPD-500型大孔吸附树脂4份，每份5.00 g，装入玻璃柱（φ1.2 cm×18 cm）中，吸取样液4份，浓度为0.76mg/mL，以流速为3 BV/h通过玻璃柱，4 BV柱体积水洗后，再用4 BV 70%浓度乙醇不同流速洗柱，收集解吸液检测虎杖苷含量。考察1、2、3、4 BV/h流速对树脂解吸率的影响。

（5）乙醇用量对解吸的影响。称取已处理好的HPD-500型大孔吸附树脂2.00 g，装入玻璃柱（φ1.2 cm×18 cm）中，吸取浓度为0.76 mg/mL上样液，以流速为3 BV/h通过玻璃柱，4 BV柱体积水洗后，再用70%浓度乙醇2 BV/h洗柱，收集解吸液检测虎杖苷含量。考察 1、2、3、4、5 BV 乙醇用量对树脂解吸的影响。

1.2.5 虎杖苷产品纯度的测定 根据以上试验确定的最佳条件，进行产品纯度验证。取等体积的上样液两份，一份直接浓缩、真空干燥得产品A。另一份上样液根据上面试验确定最佳条件过HPD-500树脂，解吸下来的洗脱液分别进行浓缩、真空干燥得产品B。将二产品进行HPLC检测。

2 结果与分析

2.1 虎杖苷的HPLC法测定

取上样液适量离心，离心液过0.45μm微孔滤膜，进样测定峰面积值，代入标准曲线方程计算质量浓度。对照品和上样液的HPLC图谱见图1，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标分别得线性方程：y=3 348 432 x-10 630，r2=0.999 9，线性范围为 0.1～

0.8 mg/mL。

2.2 虎杖苷静态吸附和解吸试验

不同树脂的物理参数及对虎杖苷静态吸附、解吸结果见表1。从表1中可看出，HPD-500型大孔吸附树的吸附量和解析率均为最高。是虎杖苷的最适分离树脂。

2.3 虎杖苷动态吸附和洗脱试验

2.3.1 上柱液浓度对吸附率的影响 上柱液浓度对吸附率的影响结果见表2。结果表明：上样液中虎杖苷质量浓度过低或过高均不利于吸附的进行，上样液虎杖苷质量浓度在0.76 mg/mL时，吸附量达到最大27.9mg。上样液较稀时，上样液粘度较小，在一定上样流速下，溶液通过柱床流速较快，虎杖苷不能有效被树脂吸收，部分虎杖苷直接流出；如果上样溶液浓度太大，被吸附物质在树脂内部扩散速度变慢，使树脂局部吸附快速达到饱和，部分虎杖苷还没来得及被吸附就流出来，这两种情况均未达到树脂的最大吸收。

图1 虎杖苷对照品（A）和样品（B）的HPLC色谱图

表1 不同树脂的物理参数及对虎杖苷静态吸附、解吸结果

表2 上柱液浓度对吸附率的影响

2.3.2 上柱液流速对吸附的影响 上柱液流速对吸附的影响结果见图2。从图2可知，上柱液流速太快，会导致吸附率降低。主要原因是上柱液跟树脂的接触时间太短，虎杖苷来不及被树脂有效吸附就直接流出。流速慢有利于树脂对虎杖苷的吸附，但是流速太慢，会使作业周期增长，浪费时间。试验结果表明，吸附时，流速以取2 BV/h为好。

图2 上注液流速对动态吸附率的影响

2.3.3 乙醇浓度对解吸的影响 乙醇浓度对解吸的影响结果见图3。结果表明：HPD-500树脂用70%乙醇解吸时解吸率高，提高乙醇浓度对解吸率影响很小，因此，应选择70%乙醇为洗脱剂。

图3 不同浓度乙醇洗脱剂对虎杖苷解吸率的影响

2.3.4 洗脱剂流速对解吸的影响 洗脱剂流速对解吸的影响结果见图4。由图4可知，洗脱流速在1～2 BV/h时有较好的洗脱效果。为提高生产效率，洗脱流速确定为2 BV/h。

图4 洗脱剂流速对解吸率的影响

2.3.5 乙醇用量对解吸的影响 乙醇用量对解吸的影响结果见图5。从图5可知，解吸率随洗脱剂用量的增加而提高，洗脱剂用量为4 BV和5 BV时两者的解吸率相近，从节能的角度考虑，乙醇洗脱剂用量宜选择4 BV。

2.4 产品纯度的测定

图5 乙醇用量对虎杖苷解吸率的影响

大孔树脂纯化效果见表3。从表3中可以看出，上柱后总虎杖苷的转移率为91.5%左右，二者总虎杖苷含量相差2.6倍，说明HPD-500树脂对虎杖苷起到了很好的吸附效果。

表3 大孔树脂纯化效果

3 讨论

不同类型的树脂对虎杖中虎杖苷的吸附性能为极性（HPD-500）>弱极性树脂（AB-8）>非极性树脂（D101、HPD-500），显示极性树脂和弱极性树脂对虎杖中虎杖苷有较好的吸附性能。解吸率也同样以HPD-500最大。原因可能是虎杖苷分子带有2个酚羟基，具有多酚的结构，显弱极性，可以作为一个良好的氢键供体，另外它接了1个葡萄糖分子，增强了虎杖苷的极性，有利于极性大孔树脂吸附。

通过对HPD-500的动态吸附研究，选用0.76 g/mL上样溶液，2 BV/h的流速过HPD-500吸附，用4BV70%的酒精洗脱为虎杖苷的最佳吸附分离条件。上样溶液经HPD-500的吸附分离虎杖苷的含量百分数从12.3%上升到32.0%，提高了近2.6倍。

研究结果表明，HPD-500树脂具有吸附快、吸附量大，易解吸等特点，优于其他几种树脂，是一种较理想的吸附分离介质。试验研究确定的虎杖苷分离工艺为进一步纯化虎杖苷提供了借鉴，亦为综合利用虎杖苷提供了参考。

[1] 许汉林，熊利容，孙 芸.Sp850树脂分离虎杖白藜芦醇苷的研究[J].药物研究，2007，16（1）：7-8.

[2] 向海艳，周春山，雷启福.大孔吸附树脂法分离纯化虎杖白藜芦醇苷的研究[J].中国药学杂志，2005，40（2）：96-98.

[3] 刘 丹，汤海峰，张三奇.大孔吸附树脂吸附纯化虎杖有效部位的研究[J].中国中药杂志，2007，32（11）：1019-1023.

[4] 刘瑞源，钟 平，陈清元.白藜芦醇苷在大孔吸附树脂上吸附性能的研究[J].天津医药，2005，33（1）：51.

[5] 刘瑞源，钟 平，周益民.大孔吸附树脂对白藜芦醇苷静态吸附性能的研究[J].广东药学，2004，14（3）：62-65.