利用荧光分析法测定玉米须中的总黄酮含量

曹叶霞，张海容，尹爱萍，何盛宝

（忻州师范学院化学系，山西 忻州 034000）

玉米须为禾本科玉蜀属植物玉米（Zea mays L.）的花柱和柱头，它含有多种化学成分，如挥发油、皂苷、生物碱、黄酮类、多聚戊糖、尿囊素、有机酸等。其味淡、性平，有利尿、泄热、平肝、利胆之功效，可用于治疗肾炎、胆结石、糖尿病、黄疸、麻疹、乳糜血尿、血崩等症[1]。现代药理研究证明，玉米须有显著的利尿[2]、降血糖[3]、抑菌[4-5]、降压、增强免疫[6]、抗癌[7]等功效。

玉米须是我国传统的中药材，全国各地均广泛栽培玉米，因此，作为玉米副产物的玉米须资源十分丰富，但对它的开发利用非常有限，除少量入药外，大部分被白白丢弃。鉴于玉米须既有明显的药理价值，又具备一定的食疗特征，进行工业化开发利用前景相当广阔。作为玉米须主要活性成分之一的黄酮类单体，国内至今尚未见报道，国外研究也不多。目前，测定食品及中草药中黄酮类的方法有直接测定法、紫外测定法[8-11]、三氯化铝比色法、硝酸铝比色法[12]、HPLC法等。

为了寻求操作简便、成本低、准确的检测方法，本研究根据黄酮类化合物能与铝离子形成稳定的荧光络合物，提出采用荧光光度法测定总黄酮的含量[13]。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

玉米须采于忻州市。将玉米须用蒸馏水洗净，阴干，然后粉碎过筛，装入试剂瓶待用。芦丁标准品为北京化学试剂公司提供。

主要仪器:F-4500型荧光分光光度计（日本日立公司）、KQ-100DB型数控超声清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）、AL204精密电子分析天平（上海梅特斯-托利多仪器有限公司）和SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（河南省巩义市予华仪器有限责任公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品溶液的制备 精密称取玉米须粉20.0000g置于100mL锥形瓶中，按料液比为1∶20加入60%乙醇溶液，在功率400 W下，超声处理20 min，过滤，用60%乙醇定容至100 mL；然后从中吸取5 mL至25 mL的容量瓶中，用60%的乙醇定容；再从中吸取1 mL，置于25 mL比色管中，加入0.1 mol/L AlCl3溶液2 mL和pH=5.3的醋酸-醋酸钠缓冲溶液6 mL，用60%乙醇定容，摇匀。

1.2.2 芦丁标准溶液的制备 精密称取芦丁20.0 mg，用60%的乙醇溶解，定容于100 mL的容量瓶中，即配成质量浓度为0.2 mg/mL的标准溶液。准确吸取标准溶液 0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL分别置于25 mL比色管中，加入0.1 mol/L AlCl3溶液2 mL和pH=5.3的醋酸-醋酸钠缓冲溶液1 mL，用60%乙醇溶液定容、摇匀，即配成标准工作溶液。

1.2.3 测定 在激发光谱通带5.0 nm，发射光谱通带5.0 nm，激发波长λex=445 nm，发射波长λem=542 nm的条件下，测定芦丁标准溶液的荧光强度。以荧光强度与相应的浓度作图，绘制标准曲线。然后在相同条件下测定样品中总黄酮的荧光强度，再用回归方程求解其含量。

2 结果与分析

2.1 荧光化合物的激发及发射光谱

按实验方法选择光谱通带宽度，对芦丁标准溶液的激发及发射光谱进行扫描。所得激发及发射光谱如图1所示，所得激发及发射光谱分别为445，542 nm。

2.2 测定条件的选择

2.2.1 pH值 溶液的pH值影响络合物的形成和荧光强度。在实验中发现，当溶液呈酸性，pH=4.74～6.74时，溶液荧光强度最大（图2）。所以，实验中选择加入pH=5.3的醋酸-醋酸钠缓冲液。

2.2.2 AlCl3溶液用量 黄酮类化合物与铝离子可生成稳定的荧光络合物。本实验考察了AlCl3的用量。实验表明，用0.1 mol/LAlCl3溶液加入1～3 mL为宜，本实验选择AlCl3的加入量为2 mL。

2.2.3 静置时间 将溶液静置于室内避免阳光直射处，并控制不同时间测定芦丁标准溶液的荧光强度（每10 min测1次），其荧光强度变化情况如图3所示。从图3可以看出，溶液荧光强度在100 min内基本保持稳定。

2.2.4 表面活性剂 在荧光的分析中，表面活性剂对荧光强度有增敏、增稳作用。本实验考察了5种表面活性剂吐温-80、十六烷基溴化铵、Op-10、十二烷基磺酸钠和氯代十四烷基吡啶对荧光强度的影响。结果表明，Op-10、十六烷基溴化铵、十二烷基磺酸钠和氯代十四烷基吡啶对本实验中荧光强度测定结果影响不大，吐温-80使荧光强度增强，但其本身也产生强荧光，对测定发生干扰，所以，本实验不加表面活性剂。

2.2.5 常见的金属离子对测定的干扰 结果表明，加入 100 倍的 K+，Na+，Ca+，Mg2+等阳离子对总黄酮的测定无影响；100倍的Ba2+对测定结果有一定的影响，100倍的Fe3+对测定的干扰较大。

2.3 校准曲线及方法的检出限

实验结果表明，芦丁为0～0.04 mg/mL时，具有良好的线性回归方程，即y=216.63x+137.93。式中，y表示荧光强度，x表示芦丁的质量浓度（mg/mL），相关系数r=0.9997，荧光强度与相应的质量浓度线性显著相关。对空白对照液进行11次平行测定，根据公式CL=3S/K计算，荧光光度法的检出限为1.08×10-9mol/L。

2.4 样品测定及回收率实验

按上述实验方法测定了玉米须中总黄酮含量，并对样品溶液进行平行测定（n=6），结果如表1所示。

表1 玉米须中总黄酮含量

由表2可知，用荧光分析法测定玉米须中总黄酮含量的平均回收率为98.3%～100.8%，实验结果说明该方法可行。

表2 样品回收率实验结果

3 结论

荧光光度法测定玉米须中总黄酮含量，检出限达到1.08×10-9mol/L。该方法灵敏度高，其准确性、重现性、线性关系、稳定性均能达到科研和生产的要求，操作简便，可广泛应用于植物中总黄酮的测定。

本实验采用荧光光度法测定玉米须中总黄酮的含量，考察了pH值、AlCl3用量、静置时间、表面活性剂以及干扰因素对荧光强度的影响，提高了测定结果的准确性。

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