DNA分子标记在念珠菌遗传多样性中的应用

熊娟 阎澜 姜远英，

(1.福建中医药大学药学院，福州 350108;2.第二军医大学药学院新药研究中心，上海 200433)

DNA分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式［1］。大致有基于 southern杂交技术、PCR反应、限制性酶切与PCR技术相结合和单核苷酸多态性等DNA分子标记［2］。目前，已经应用的有几十种DNA分子标记，最常见的如随机扩增多态性DNA (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、扩增片段长度多态性 (Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)、简单序列重复标记(Simple Sequence Repeats，SSR)、单核苷酸多态性(Single-Nucleotide Polymorphisms，SNPs)等［3］，已被广泛地应用于真菌遗传图谱构建、基因定位及克隆、遗传多样性和分离菌株的DNA鉴定等方面的研究。

利用传统的真菌分类方法常引起分类系统的不稳定或分歧，核酸技术为真菌检测开辟了一条新的有效途径，它可用于真菌种的鉴定，更多的是用于亚种、变种水平上的鉴定。条件性致病念珠菌尤其是白念珠菌 (Candida albicans)是医院感染常见病原真菌，现已成为艾滋病、肿瘤、移植和吸毒等免疫缺陷患者的死亡原因之一。因此确定念珠菌的感染源和传播途径意义重大，这不仅需对念珠菌在种间水平分类，还需深入到种内甚至亚种水平。运用分子标记技术可以将不同菌株基因分型，快速、准确地鉴定出不同菌株，以深入对其流行病学和耐药机制的了解［4-5］，这对医院抗菌药物使用及寻找新的抗真菌药物具有重要指导作用。

1 RAPD标记技术

1.1 RAPD标记技术原理及其特点

RAPD 标记是 Williams等［4，6］于 1990 年建立的基于PCR基础之上的分子标记技术。它采用人工合成的较短的随机排列碱基顺序的核酸单链(通常为10个核苷酸左右)为引物，在一种热稳定DNA多聚酶的作用下，对所研究的未知序列的基因组DNA进行PCR扩增以检测其多态性。

实验中DNA的用量少，减少了大量的提取工作。但其实验稳定性和重复性差;其次是显性遗传，不能识别杂合子位点，这使得遗传分析相对复杂［7-8］。

1.2 RAPD在念珠菌中的应用

白念珠菌的基因型特性对于研究其致病性具有重要意义。RAPD技术可用于念珠菌的多态性及其亲缘关系的研究，其条带可以清楚显示念珠菌及其相关酵母菌属间、种间及种内基因组型的差异。孙静等［9］研究108株白念珠菌临床分离株，经PCR 25S rDNA分析分为3型:A(31株)，B(68株)，C(9株);而RAPD指纹技术分析产生21种基因型。对比两种结果发现PCR 25S rDNA方法中A组菌株在RAPD技术分析时又被细分为11种基因型，B组被分为16种。结果显示在对白念珠菌进行种内分型时，RAPD指纹技术优于PCR 25S rDNA，更能反映出种内不同菌株间的差异。Giammanco等［10］的研究也充分证明了这种方法在白念珠菌基因分型方面的有效性。

RAPD与传统的生物化学等方法相比，在区分不同基因型的白念珠菌时具有更高的分辨力。Costa CR等［11］利用RAPD方法研究发现，在14株遗传图谱表现一致的白念珠菌中有4种不同的基因型，说明在白念珠菌中存在高度的遗传多态性。此外，他们还观察到600 bp和450 bp的保守带型，这对于白念珠菌的鉴定和利用RAPD对白念珠菌流行病学的研究具有重要意义。

运用RAPD方法选择非特异性引物，通过PCR产生一系列片段作为菌株基因分型的基础，项明洁、彭奕冰等［12］用相同序列的随机引物和相同的优化条件，对从医院患者中分离的105株菌株进行RAPD分析。获得的RAPD谱型各不相同，其中102株白念珠菌集中分布于5个主要型别中，另3株各成一型。这为目前临床上白念珠菌的流行提供了资料，并验证了该方法对白念珠菌基因分型的可行性。

2 AFLP标记技术

2.1 AFLP技术原理及其特点

AFLP技术结合了限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)技术和RAPD技术，是1993年由荷兰Keygene公司的Zabean等发明，它将基因组DNA用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段用接头连接起来，并通过N端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA片段，从而形成指纹图谱的分子标记技术。因此其具有RAPD的高效性特点，又兼有RFLP的稳定、可重复性强的特点［13］。

但是，目前AFLP是一种受专利保护的技术，只能用于非盈利的科学研究。此外，基因组的不完全酶切会影响实验结果，因此对内切酶的质量要求较高，用于遗传作图时，少数的标记与图谱紧密度有出入。

2.2 AFLP在念珠菌中的应用

不同种的念珠菌可同时感染同一机体，而某一部位感染的菌株尽管其表现的形态不一致，但基因型却是一致的，故仅靠表型和血清学方法对不同致病性念珠菌进行鉴别是困难的。Candida orthopsilosis和Candida metapsilosis曾被认为是近平滑念珠菌的种内变种，运用分子系统学和其遗传差异分析发现:C.orthopsilosis和C.metapsilosis是单独的种类［14］。常规的遗传和生理生化手段难以达到菌株水平的区分，必须借助于DNA分子标记方法来完成。Hensgens等［15］用AFLP考察了从临床中分离出的391株菌株中C.orthopsilosis和C.metapsilosis出现的频率，C.metapsilosis约占5%(20株)，这一数据进一步证明了C.metapsilosis在临床中出现并与机体感染有关的报道，并推翻了之前的说法:几乎不可能从感染人体真菌中分离到一个新的菌种。在AFLP分析中采用4种不同的引物组合，共得到68个不同的带型，比较菌株的AFLP图谱可知:在C.metapsilosis中存在着遗传多样性。该标记不仅增强了检测技术的辨别能力，同时可检测到大量的多态性片段。

已有研究表明光滑念珠菌遗传变异性很低，为了更深入研究其染色体组型和表型，Tavanti等［16］从四个不同国家不同类型感染的患者体收集了62株光滑念珠菌，运用AFLP来鉴定其种别和种内差异性。AFLP结果表明:收集的62株菌株基本无种的变异，其相似系数为0.97;AFLP多态性条带很少，与 Butler等［17-18］的研究结果也一致:光滑念珠菌没有明显的序列差异。

3 SSR标记技术

3.1 SSR技术原理及其特点

1991年Mooer等结合PCR技术创立了简单重复序列标记技术，又称微卫星DNA(Microsatellite DNA)、短串联重复 (Short Tandem Repeat，STR)或简单重复序列长度多态性(Simple sequence length polymorphisms，SSLP)。它是以少数几个(一般为1～6 bp)核苷酸为重复单位的首尾串联重复DNA序列。其标记的基本原理是根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段。

SSR在原核和真核生物基因组中均有分布［19］，多态性丰富，微卫星检测方法简易高效安全，并可以多个位点同时进行检测;但是微卫星进化具有复杂性，可能出现同源异型或异源同型;建立和筛选基因文库，进行克隆和测序，都非常繁琐、耗时;目前还没有发现哪个DNA探针能很好地匹配他们各自的多态性。

3.1 SSR标记技术在念珠菌中的应用

在引起血液感染的念珠菌中，光滑念珠菌是较常见的临床分离菌株之一［20-21］。新微卫星位点的鉴定能够区分出不同的菌株。Sabino等［22］选择了4个特异性的标记序列对233株光滑念珠菌进行了基因分型，结果发现其多态性位点出现在20～42个等位基因中和39～92种基因型中，在多样性分析中发现了192个基因型。将SSR标记和其他几种分子标记如RFLP、ITS等鉴定出的基因型比较发现:SSR区分菌株之间的差异能力明显高于其他几种方法。

SSR标记对区分念珠菌是非常有力的工具，对流行病学中念珠菌相关性，医院之间交叉感染，及其从繁殖到感染的动力学研究具有重要作用。Barada等［23］考察了从黎巴嫩的5个医院收集的125株念珠菌，采用SSR基因分型方法对其进行研究发现:SSR方法对菌株鉴定结果错误率在2%～33%不等，平均为7%;用SSR方法鉴定出具有相同基因型的菌株在几个医院均有出现，排除了医院感染因素的可能性。采用SSR基因分型法，研究还发现杂合子等位基因异质性丢失可导致菌株对唑类药物的耐受。

4 SNPs标记技术

4.1 SNPs技术原理及其特点

SNPs主要是指近缘种群或同种个体基因组水平上由于单核苷酸变异所引起的DNA序列多态性，其多态性频率大于1%，常表现为核苷酸的转换、颠换。SNPs分析技术按其研究对象主要分为两大类:一是寻找未知的SNPs或确定某一未知SNPs与某种遗传病的关系;二是对不同群体的SNPs遗传多样性进行检测或在临床上对已知致病基因的遗传病进行基因诊断。由于SNPs密度高、富有代表性、遗传稳定、易自动化分析等特点使其作为一类遗传标记得以广泛应用。

4.2 SNPs标记技术在念珠菌中的应用

白念珠菌是临床治疗中最广泛的条件致病菌，有广谱的致病性和很强耐药性，其重要原因就是基因变异。研究表明白念珠菌具有促进基因变异的遗传机制，在营养物质充分和抗真菌药物的作用下就可以启动这些机制。Forche等［24］采用 SNPRFLP方法来检测白念珠菌中杂合子缺失 (loss of heterozygosity，LOH)。该方法是基于限制性酶分析的。所选用的SNP-RFLP标记均只有唯一的限制性酶切位点。在研究YJB10019菌株和其亲本菌SC5314时发现，chrR、chr1、chr2上的4个标记在YJB10019中都是纯合子，在SC5314中都是杂合子。表明:在白念珠菌中部分或全部染色体存在杂合子缺失，此结果与之前Forche的研究结果［25］也一致。

基因序列显示白念珠菌SC5314中大约有62 000个SNPs，对于研究其群体遗传学和菌株之间的关系是一巨大资源。Forche等［26］通过建立白念珠菌全基因组SNPs图谱，研究了有丝分裂重组包括杂合位点基因转变，染色体缺失等在白念珠菌体内、外毒力变化中的作用。该图谱包含131个标记共561个SNPs，其平均密度是1/111 bp，标记序列全部或部分在编码区。白念珠菌耐药性机制之一就涉及到在基因ERG11上的LOH。运用SNP技术研究了几株由亲本菌SC5314经基因敲除后得到的菌株后发现，LOH与基因处理如基因敲除，或在选择性培养基生长没有直接的关系，即基因处理不会直接导致LOH的增加。

5 小结与展望

随着生物标记技术及分子生物学的发展，DNA分子标记技术也在不断完善，目前还没有哪种DNA分子标记可以同时满足所有应用的需要。本文所介绍的几种DNA分子标记技术，是现阶段念珠菌种鉴定和遗传多样性研究中使用最广泛、简便和有效的技术。从菌株的鉴别能力方面比较，RAPD、AFLP技术已能满足研究和生产的需要。RAPD标记的位点多、大量随机引物的使用，使RAPD标记覆盖物种的整个基因组，目前被认为是最有前途的群体遗传标记。AFLP可在一次试验中同时检测到更多的多态性片段，有助于遗传差异的更完全综合和在相似群进一步分类，因而将在生物多样性、微生物鉴定、遗传等领域做出贡献，同时也将是基因表达和调控、数量性状基因研究的有效工具。SSR对大规模的流行病学研究是一个很好的选择，在区分临床菌株、研究医院间真菌交叉感染、真菌繁殖到感染的代谢动力学的研究方面是很重要的工具。SNPs在基因组广泛而稳定地存在，提供了一批很好的分子标记，在高密度遗传图谱构建、基因的精确定位、群体遗传结构分析等方面均具有广阔的应用前景。大规模的SNPs分型需要准确可靠的检测方法作为技术支持，所以在未来的SNPs发展中，建立一种快速、准确、可靠且成本低廉的方法是SNPs分型的发展方向。

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