转基因耐草甘膦作物的环境安全性

李香菊， 崔海兰

（中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193）

据联合国粮农组织统计，世界每年因草害造成的作物产量损失达950亿美元［1］。2009年，全世界农药销售额达401．62亿美元，其中，除草剂、杀虫剂、杀菌剂分别占44．5%、25．4%和25．5%［2］。在除草剂应用过程中，药剂在杂草和作物之间的选择性是其有效除草而不伤害作物的基础，合成广谱高效、对作物安全的除草剂产品一直是国内外化学工业研究的热点。然而事实上，除草剂高活性、杀草谱广和对作物安全一直是一对矛盾，很多除草效果非常理想的药剂由于对作物安全性差而失去了在作物田选择性除草的价值。

生物技术的发展尤其是基因重组技术为培育耐除草剂作物提供了新的途径［3］，由于转入了耐除草剂基因，使 “目标”除草剂对作物的安全性大大提高，作物原来敏感的除草剂也能够应用于作物田，有选择地杀死杂草而不伤害作物［4－5］。

然而，像任何新技术的出现一样，转基因耐除草剂作物的大面积种植也引起了全球对其环境安全问题的广泛关注。在这方面，国外已经就其进行了近20年的研究，基本明确了耐除草剂作物对环境的影响，研究表明：目前商业化的转基因耐除草剂作物不减少当地作物遗传多样性，入侵农田以外周边环境的风险较小；对非靶标生物、杂草群落演替等无明显影响，亦无杂草化倾向；在抗性基因向作物野生种漂移、抗性基因对作物起源中心的基因库及遗传多样性的影响方面的风险均是可控的。到目前为止，我国尚无耐除草剂作物商业化种植，但是已经拥有了具自主知识产权的基因，转基因育种工作已经取得进展。随着国家政策的完善及育种工作的深入，未来几年耐除草剂作物将纳入我国杂草治理体系。基于此，笔者以耐草甘膦作物为例，对国内外环境安全的相关研究结果进行归纳和总结，为我国转基因耐草甘膦作物的环境安全评价及耐草甘膦作物的管理提供参考。

1 世界耐草甘膦作物现状

草甘膦是1970年孟山都公司开发出的内吸传导型广谱灭生性茎叶处理除草剂。其主要作用靶标是莽草酸合成途径中的5－烯醇丙酮莽草酸－3－磷酸合成酶（EPSPS）。因为对EPSPS的抑制，经其催化由磷酸烯醇丙酮酸与莽草酸－3－磷酸向5－烯醇丙酮莽草酸－3－磷酸的转变过程停止，从而抑制植物体内必需的芳香族氨基酸（酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）的生物合成，并使以后酚类、木质素、单宁及其他苯丙素类的合成受阻。在植物体内，EPSPS主要存在于叶绿体和质体中，绿色植物喷施草甘膦后，草甘膦优先与EPSPS的活性位点结合，使后者发生构型上的变化，从而抑制其与磷酸烯醇丙酮酸的结合和随后的催化反应。大部分绿色植物对草甘膦不能降解或代谢较慢，并且草甘膦能有效地传导到植物的分生组织等代谢旺盛部位，从根本上抑制其生长。草甘膦的这种独特的作用靶标和作用机制，使其具有杀草谱广、杂草不易产生抗性、无土壤残留、对动物低毒性等特性［6－7］。草甘膦的杀草谱包括了几乎所有的一年生杂草和多年生杂草及部分灌木，遗憾的是常规作物也会被草甘膦杀死，因此草甘膦过去主要用于非耕地、果园、林地、作物播种前喷施及定向喷雾杀除杂草［8］。

1983年，孟山都公司及华盛顿大学的科学家从土壤农杆菌（Agrobacteriu m tumef aciens）分离到高耐草甘膦的CP4菌株（该菌株的EPSPS对草甘膦不敏感），并于1986年成功将epsps基因插入植物基因组中获得耐草甘膦植物，1996年，注册商标为Roundup Ready的世界首例耐草甘膦作物商业化。耐草甘膦作物的研发成功使草甘膦这一灭生性除草剂在作物田应用成为现实。至2010年，耐草甘膦大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜以及苜蓿等6种作物商业化种植，仅耐草甘膦大豆就达7 330万h m2，占全球转基因作物种植面积的50%［5］，占世界大豆总种植面积的77%左右。其中，美国、阿根廷和巴西耐草甘膦大豆播种面积分别达91%、99%和71%。

耐草甘膦大豆GTS 40－3－2于1991年开始田间试验，是孟山都公司采用基因枪轰击方法将cp 4 epsps基因转入第V成熟组的大豆常规品种 ‘A5403’获得的转化体，该转化体含Ca MV e35S启动子，2个拷贝的增强子及来自于矮牵牛epsps基因的叶绿体转运肽序列。与其受体相比，该转化体的生物学性状及农艺性状并无明显变化，而且，由于该转化体的雄性器官如绒毡层及发育中的花粉粒对草甘膦具有较强的吸附能力，很容易受到草甘膦的伤害，因此并不增产。2007年，MON89788商品化，该转化体与前者含有相同epsps基因，但其插入位点与GTS 40－3－2不同并含有增强启动子及调控单元，提高了epsps在营养器官及雄性组织中的表达，具有比第1代耐草甘膦大豆更优异的农艺性状及产量。另一大豆耐草甘膦转化体356043由先锋公司研发成功，与GTS 40－3－2不同的是，该转化体转入了来自于地衣芽胞杆菌［Bacillus lichenif or mis （Weigmann）Chester］的 基 因，表 达Gat4601（glyphosate acetyltransferase，即草甘膦乙酰转移酶），能够通过转乙酰基反应将草甘膦代谢为低毒物质乙酰草甘膦，通过基因改造的基因定向进化技术，该酶的活性提高7 000倍，对草甘膦表现较强的耐受性，同时表达GM－HRA，从而耐草甘膦及磺酰脲类除草剂。之后，其他作物耐草甘膦转化体相继商业化，至2010年商业化的耐草甘膦转化体有：抗虫／耐草甘膦／耐草铵膦玉米GA21，耐草甘膦玉米NK603，耐草甘膦／抗ALS抑制型除草剂玉米98140，耐草甘膦棉花 MON 1445、MON 88913、GBH614；耐草甘膦油菜GT73，耐草甘膦苜蓿J101和J163以及耐草甘膦甜菜 H7－1［3］。目前，其他复合性状（或叠加性状）的转化体也正在或即将获得商业化种植，如耐草甘膦／麦草畏大豆、耐草甘膦／异恶唑草酮大豆、抗虫／耐草甘膦玉米等。

2 耐草甘膦作物的环境安全

耐除草剂作物的环境风险主要包括以下几部分：（1）耐除草剂作物种植产生的直接影响：如耐除草剂作物种植是否减少当地作物遗传多样性、耐除草剂作物自生苗是否影响杂草治理、耐除草剂作物是否侵入农田以外的周边环境等；（2）抗性基因逃逸的风险：如耐除草剂基因向其野生种及近源杂草的漂移、引起作物起源中心及多样性中心基因库的变化等：（3）耐除草剂作物种植带来的间接影响：“目标”除草剂应用使耕地面积扩大对原有生物群落的影响、对非靶标生物的影响，“目标”除草剂使用对生态系统的影响包括除草剂漂移对农田周边生境的影响等［9］。

2．1 耐草甘膦作物种植带来的自生苗问题

作物收获时，部分种子会撒落于田间，下茬或来年出土，这些植物称为自生苗。从杂草的定义来讲，作物自生苗也属于杂草的范畴。自生苗影响后茬作物生长，但并不是转基因耐除草剂作物才会产生自生苗，常规作物品种也有同样的问题［10］。作物种类不同，自生苗产生率及存活率有差异。相对来说，小麦、油菜、大豆等作物由于其种子易落粒、果实易开裂等固有的生物学特性，产生自生苗的几率远大于玉米、棉花等作物。大豆种子无休眠，如果种子落粒后温、湿度条件适宜，大豆会很快发芽，产生自生苗，而未出苗的种子在田间很快丧失活力。另外，目前商业化的耐草甘膦作物除了苜蓿外均为一年生或越年生，自生苗很难越冬（玉米、大豆、棉花）或越夏（油菜、甜菜）产生种子。大量研究表明，转基因作物本身产生自生苗的几率及其演化成杂草的可能性不比非转基因亲本植物大。如耐草甘膦大豆MON89788与其受体A3244相比，在生物学性状、种子寿命、繁殖系数、自生苗产生率等竞争性方面无差别，在种子休眠、扩散、入侵农田以外的生境，变为野生优势种等杂草特性方面亦与其受体A3244无差别［11］。近些年，我国在该领域也开展了研究工作，同样也没有发现耐草甘膦作物比非转基因亲本作物有更强的生存竞争力。普遍认为，耐草甘膦作物演化成杂草的可能性与其亲本无差异。

然而，某些转基因耐草甘膦作物的自生苗治理仍然是需要关注的问题。Gr uber研究发现，在油菜（Br assica napus）收获前后全田有1．5%的种子落粒，产生大量自生苗，而且有4%～29%的种子进入土壤种子库［12］，由于存在着二次休眠，种子可在土壤存活数年［14］，增加了治理难度及基因漂移风险。另外，也发现耐草甘膦油菜能够在路边至少存活8年［13］，说明其有长期存在于农田以外的自然及半自然生境的风险。

在连续种植耐草甘膦作物时，下茬作物耐草甘膦自生苗不能靠单喷施草甘膦防除，但是，选择具有不同杀草机理的除草剂与草甘膦混用、播种前后机械耕作及轮作等措施均可有效控制耐草甘膦作物自生苗危害［14］。

2．2 耐草甘膦作物抗性基因漂移的风险

基因漂移是一种并非转基因作物特有的自然现象，它是指某一生物群体的遗传物质（基因）通过媒介转移到另一生物群体的自然过程。基因漂移可分为花粉介导及繁殖器官介导［15］，目前公众所关注的转基因作物基因漂移风险主要是指花粉介导的基因漂移。在过去的十几年里，国内外开展了大量研究工作评估转基因植物与相应非转基因植物及其野生近缘种植物间基因漂移发生的可能性及不同转基因植物间发生基因漂移的潜在距离和频率。发生基因漂移要求以下条件：花粉供体及受体同时生长、花期相遇及成功授粉和受精。作物种类、环境条件及生产实践均影响基因漂移率，例如，庞大的耐除草剂作物群体及正常生长的自生苗、大量可交配的亲本、异花授粉方式或自交不亲和、花粉源多花粉量大、花粉粒轻、风力大（对风媒花而言）、授粉昆虫多（对虫媒花而言）、花粉寿命长及低温、高湿的环境都能提高基因漂移率；而空间隔离、时间隔离、有隔离带、控制自生苗等均会降低基因漂移率。

研究表明：世界目前商业化的6种耐草甘膦作物不论是自花授粉还是异花授粉均存在一定的基因漂移风险，但这种风险是可控的。大豆是自花授粉作物，一般在开花前就完成了受精，而且大豆花粉粒较重，不易随风传播。因此，栽培大豆之间的异交率较低，常小于1%，但某些品种在有利条件下异交率可超过2．5%。随着与花粉源距离的增加，栽培大豆异交率降低，一般在距离花粉源10 m之外异交率为0。巴西研究了耐草甘膦大豆与栽培大豆间隔不同距离种植的异交率，发现在距花粉源1、2、5 m和10 m处，耐草甘膦大豆的花粉漂移率分别为0．52%，0．12%、0．01%和0［16］。由于栽培大豆的种植区域是人为相对可控的，因此，人们更为关注的是转基因耐草甘膦大豆与野生大豆之间的基因漂移。日本对23个野生大豆种的研究发现，栽培大豆向野生大豆的基因漂移率为0～5．89%，平均为0．73%［17］。陈新等研究了我国从阿根廷引进的耐草甘膦大豆在田间种植后抗性基因向栽培大豆及其近缘野生种漂移的可能性，未发现耐草甘膦基因向栽培大豆漂移，但检测到了其向野生大豆漂移，漂移率为0．09%［18］。上述结果说明，尽管异交率很低，但耐草甘膦大豆向常规栽培大豆和野生大豆发生基因漂移的可能性是存在的。栽培大豆及野生大豆的隔离距离10 m以上，即可避免抗性基因向栽培种及近缘种的漂移。棉花是常异花授粉作物，其花粉很黏，不易借风传播。耐草甘膦棉花与常规棉花之间的异交率因田间传粉昆虫数量及棉花品种而异，与隔离距离也有较大关系。国外研究表明，两者相邻种植时异交率可达47%，在距花粉源15 m之处，异交率降低到3%以下。一般来说，陆地棉品种30 m隔离距离以外就不容易发生异交［15］。张宝红等研究了我国转基因棉花的外源基因漂移情况，发现抗性基因最高漂移频率为10．48%，最远漂移距离可达50 m［19］。玉米是异花授粉作物，自交率仅5%左右。尽管玉米花粉粒大而重，但也可借助风力传播至较远的距离，在相邻行异交率为82%，而距花粉源28 m处异交率降至1%以下。花粉漂移率除了与距离关系较大以外，与风向也有一定关系，顺风方向花粉漂移率高于逆风方向。Ku mar等发现，西北、正西和正北方向玉米花粉漂移率高于其他方向，在距花粉源2．5 m处上述三个方向耐草甘膦玉米花粉最大漂移率分别为9．94%、8．5%和7%，在距花粉源25 m处花粉漂移率仅0．13%，而25 m以外采集到的耐草甘膦玉米花粉基本无活力［20］。油菜为异花授粉（白菜型）或常异花授粉（甘蓝型）植物，且花粉能借风或昆虫远距离传播。研究发现，油菜有10%的花粉能漂移到距花粉源360 m处，传播至1．5～2．5 k m处的花粉仍有活力。油菜同一类型之间的异交率较高，容易产生抗性基因漂移。1998年，加拿大在上年种植耐草甘膦油菜（B．napus）及相邻种植抗草铵膦／咪唑啉酮类除草剂转基因油菜的田块，发现了抗3种除草剂的油菜自生苗，对幼苗的RFLP分析证实，这些自生苗是由于花粉漂移产生的杂交种［21］。油菜不同类型之间的异交率低于同一类型品种间的异交率，如甘蓝型油菜与白菜型油菜（B．r apa）田间异交率为0～36%，而且其F1花粉活力及适合度均明显降低。甘蓝型油菜与十字花科杂草如野欧白芥（Sinapis ar vensis）、野萝卜（Raphanus r aphanistr um）及狗芥（Er ucastr um gallicum）的基因漂移概率很低，仅（2～5）×10－5，而且杂交种多雄性不育，例如甘蓝型油菜与野萝卜人工杂交，杂种F1花粉仅0．12%有活力。总的来看，耐草甘膦油菜的抗性基因向其近缘杂草的漂移可能性极小，但是油菜不同类型之间，与油菜自生苗之间及与白菜之间的抗性基因漂移是不可避免的［22］。

上述结果也说明，同种耐草甘膦作物在不同的生态环境中基因漂移率差异较大，难以从局部的某些试验研究推断耐草甘膦作物大范围的基因漂移情况。但是，由于隔离距离在很大程度上决定着基因漂移率，因此采用距离隔离是控制耐草甘膦基因向栽培种及野生近缘种漂移的有效途径。

2．3 耐草甘膦作物种植带来的杂草抗药性风险

杂草在进化过程中，由于这样或那样的原因，会产生对除草剂不敏感的自然突变体，在除草剂选择压的作用下，一些对除草剂敏感的杂草种群被杀死，而那些对除草剂不敏感的自然突变体被保留下来，发展成抗药性种群，即杂草对除草剂产生了抗药性。

截至2011年，全球有197种杂草的365个生物型对21类除草剂产生了抗药性［23］。草甘膦抑制络氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的生物合成，由此引起杂草几个方面的代谢失调，例如抑制蛋白质及其次生产品的生物合成，使莽草酸途经异常造成杂草体内基本代谢破坏等等［27］。因此，与一些作用靶标单一的药剂如ALS抑制剂相比，草甘膦使用带来的杂草抗药性风险是比较小的。磺酰脲类除草剂使用仅20余年，世界有报道的抗磺酰脲类杂草多达121种，三氮苯类除草剂使用40多年，抗三氮苯类除草剂杂草生物型为69种，而草甘膦商业化应用至今40多年，到2011年已报道的抗草甘膦杂草仅有21种，包括长芒苋（Amaranthus pal meri）、糙果苋 （A．tuberculatus）、具瘤苋（A．r udis）、豚草（Ambrosia artemissif olia）、三裂叶豚草（A．trif ida）、石茅（Sor ghu m halepense）、类黍尾稃草（Urochloa panicoides）、白苞猩猩草 （Euphorbia heterop hyll a）、硬直黑麦草（Loliu m rigidu m）、多花黑麦草 （L．multif lor u m）、小白酒草（Conyza canadensis）、牛筋草（Eleusine indica）等。其中，有的抗草甘膦杂草也不是在耐草甘膦作物田发现的，如长叶车前（Pl antago l anceol ata）、银胶菊（Partheniu m hysterophor us）、牛筋草（Eleusine indica）、光头稗（Echinochloa colona）、黑麦草属（Loliu m spp．）、小白酒草属（Conyza spp．）等在持续使用草甘膦除草的路边、果园、水渠边等处发现。我国虽然未种植耐草甘膦作物，但也发现了抗草甘膦小白酒草。当然，随着耐草甘膦转基因作物的广泛种植，可能导致在同一地区连年施用草甘膦，在除草剂的高选择压下，杂草将不可避免地产生高耐受性。例如，美国在连续种植耐草甘膦大豆和棉花的农田发现了抗药性倍数比敏感型高8～12倍的抗药性小白酒草［24］。

实践证明，可以通过更换除草剂或在喷施草甘膦时加入其他除草剂来实现抗草甘膦杂草的有效控制。例如，美国在治理棉田抗草甘膦牛筋草时，采用草甘膦喷施时加入禾本科杂草除草剂的办法达到了理想效果。

2．4 耐草甘膦作物种植对作物遗传多样性的影响

作物丰富的遗传多样性无论对人类健康膳食还是对农业生产都有着重要意义［25］。耐除草剂作物由于外源基因的插入，从理论上讲丰富了作物的遗传多样性；但是由于每种耐草甘膦作物的转化体数量有限，有人担心只种植这些转化体可能会使某一特定区域内作物的遗传多样性减少［9］。然而，转基因作物的商业化及应用历程表明，由于上述有限的转化体远不能满足不同区域的生态条件对作物农艺性状的要求，各育种机构往往采用常规育种方法，以耐除草剂转化体做亲本，具有优良农艺性状的当地常规品种做另一亲本，通过杂交及多次回交，使其后代除了增加耐草甘膦性状外其他主要农艺性状与当地常规品种相同。因此，每个生态类型区农民种植的耐草甘膦品种是多种多样的。以耐草甘膦大豆为例，美国通过常规杂交方法已经将GTS 40－3－2和MON89788的耐草甘膦性状转移到了很多常规大豆品种中，使目前商业化的耐草甘膦大豆品种达1 000多个［3］。

2．5 耐草甘膦作物种植对生物多样性的影响

对农田杂草种群多样性的影响：Hear d等对60多块分别种植耐草甘膦油菜、甜菜、玉米、大豆等作物和常规作物的田块杂草种子库及杂草密度的研究发现，在甜菜和油菜田，耐草甘膦作物田的杂草密度低于常规作物田，杂草生物量及种子数量也分别只有常规作物田的1／3和1／6；而在耐除草剂玉米田结果相反，杂草密度高于常规玉米田，杂草生物量及种子数量分别比常规玉米田高82%和87%。而且，耐除草剂作物田与常规作物田相比，杂草种类多样性不受影响［26］。也有一些相反的报道，认为由于农田存在对草甘膦有天然耐受性的杂草种群，因此在连续使用草甘膦后会引起杂草群落演替。在美国佐治亚州耐草甘膦棉田，杂草优势种群由1995年的莎草科、狗牙根、藜等演替为鸭跖草、长芒苋、番薯属等［27］。也有研究发现，种植耐草甘膦作物会引起田旋花（Convol vul us ar vensis）、百脉根（Lotus cor nicul atus）、饭包草（Commelina benghalensis）、狗肝菜（Diclipter a chinensis）、藜（Chenopodium albu m）、苘麻（Abutilon theop hr asti）等草甘膦较难防除的杂草密度增加［24］。

对农田非靶标生物种群动态的影响：国内外开展了大量研究工作评价耐草甘膦作物对节肢动物群落多样性的影响［9，28－31］。研究表明，转基因耐草甘膦作物不影响节肢动物生物多样性。但是转基因抗除草剂作物的种植将可能改变农田杂草结构及农田耕作和管理措施，进而可能通过改变农田动物的栖息地小气候环境、食物链关系和食物成分影响动物的群体结构和种群动态。吴奇等研究了我国种植耐草甘膦转基因大豆对豆田生物多样性的影响，结果表明，耐草甘膦转基因大豆AG5601小区的害虫多样性指数、优势度、物种丰富度、均匀性指数与受体品种‘SN K500’差异不显著；主要害虫烟粉虱、大豆蚜、烟蓟马的发生数量与受体品种‘SN K500’差异不显著，说明耐草甘膦转基因大豆对害虫群落没有影响［32］。

国内外对耐草甘膦作物种植对土壤微生物的影响做过大量研究，发现某些微生物有增加，而另一些微生物数量有减少趋势。Powell和Castro的研究结果表明，耐草甘膦转基因大豆根际土壤的镰刀菌群落有明显的增加，指出根际镰刀菌可以将根系分泌物中的草甘膦作为P和C的来源。也有研究表明转基因作物释放到根际的草甘膦将与碳水化合物或高浓度氨基酸相结合有利于增加镰刀菌生长。刘佳等采用室外小区试验方法，研究了耐草甘膦转基因大豆对根际土壤细菌、真菌、放线菌的影响。结果显示，耐草甘膦大豆显著降低了根际土壤细菌和放线菌的数量，提高了根际土壤真菌的数量［33］。但上述影响也可能与喷施草甘膦处理有较多作物秸秆有关［9］。

国外有使用草甘膦后影响土壤中金属离子活性的报道，但未被大量试验证实。理论上讲，选择使用草甘膦除草，每次投入的草甘膦活性成分仅60 g／667 m2左右，不足以影响土壤中的金属离子活性。美国等国家大面积连续种植耐草甘膦作物15年以上，并未发生其影响作物对其他金属离子吸收的情况。而且，耐草甘膦作物种植由于使用了对人畜低毒的除草剂，对土壤、水污染小于种植常规作物所喷施的除草剂的影响［31］。

耐除草剂作物的种植与引入一个非转基因作物新品种一样可能会因为引起农田耕作和管理措施的改变，而负面或正面地影响农田系统生物多样性。但这些影响是比较微小的，属于可控范围。

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