抗氧化应激转录因子－Nrf2的研究进展*

林晓萍， 李 雯， 沈华浩

(浙江大学医学院附属第二医院呼吸科，浙江杭州310009)

细胞毒物、致癌物以及亲电子试剂在外界环境中无处不在，这些物质及其代谢产物直接或间接干扰DNA、蛋白质和脂质等生物大分子的生理功能，参与各种疾病包括肿瘤、老化、哮喘、急性肺损伤、动脉粥样硬化、神经退行性疾病和自身免疫病等疾病的病理生理过程，时刻威胁人类健康。为了对抗各种外来物质的攻击，细胞在进化过程中逐渐获得了对抗这些毒性物质的防御能力。其中一个对抗氧化应激最重要的细胞防御机制是由核因子E2相关因子2(nuclear factor－E2－related factor 2，Nrf2)所介导的，Nrf2通过与胞浆蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白－1(Kelch－like epichlorohydrin－associated protein 1，Keap1)以及抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)相互作用，启动下游编码抗氧化蛋白和II相解毒酶的基因表达，发挥细胞保护作用。

1 Nrf2、Keap1基本结构

1.1 Nrf2的基本结构 Nrf2是CNC(cap'n'collar)转录因子家族成员中活力最强的转录调节因子，主要表达于如肝脏、肾脏等代谢和解毒组织中，以及其它持续暴露在环境中的组织如皮肤、肺、消化道等，普遍表达于各种细胞［1］。

人类Nrf2与鸡、鼠Nrf2具有同源性，均含有6个高度保守的环氧氯丙烷(epichlorohydrin，ECH)相关蛋白同源结构域(Nrf2－ECH homology，Neh)［1－3］。分别如下:(1)Neh1 区:含 1 个 CNC 类型的碱性亮氨酸拉链结构(basic leucine zipper，bZ-ip)，必须与其它转录因子形成异二聚体后才能识别并结合ARE，启动目标基因转录。此外，该区还含有功能性核定位信号(nuclear localization signal，NLS)和富含亮氨酸的核输出信号(nuclear export signal，NES)，参与调控Nrf2的核转位和降解;(2)Neh2区:与胞浆蛋白Keap1的Kelch区相结合;(3)Neh3:是活化转录所必需的，通过招募共激动剂－染色质解螺旋酶DNA结合蛋白6(chromodomain helicase DNA－binding protein 6，CHD6)活化转录，不过目前还不知道CHD6的特定功能;(4)Neh4和Neh5:富含酸性氨基酸残基，是2个独立的激活区，二者协同激活环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cyclic AMP response element－binding protein，CREB)结合蛋白(CREB－binding protein，CBP);(5)Neh6区:富含丝氨酸残基，与Nrf2氧化－还原非依赖的负性调节有关，但目前尚不清楚其作用或重要性。

1.2 Keap1的基本结构 Keap1是Kelch家族多区域阻遏蛋白。正常情况下锚定于胞浆、栓在肌动蛋白细胞骨架上［2，3］。人类Keap1蛋白一级结构包含5个区，分别是:(1)N末端区域;(2)BTB(bric－abrac/tramtrack/broad complex):是在肌动蛋白结合蛋白和锌指转录因子中发现的一个蛋白－蛋白相互作用的进化保守基序，通常和其它BTB区形成二聚体，是Keap1与Nrf2解离、阻止II相基因转录所必需的;(3)干预区(intervening region，IVR):该区域不仅富含半胱氨酸，而且含有Keap1活性最强的半胱氨酸残基，是整个蛋白的功能调节区，不仅参与亲电化合物及氧化剂的反应，同时还参与形成泛素化连接酶、稳定Nrf2;(4)双甘氨酸或Kelch重复区(double glycine or Kelch repeat，DGR区):含有6个双甘氨酸重复序列或6个Kelch模序，重复的Kelch模序形成6片经典的β螺旋，含有多个潜在的蛋白质结合位点，是Keap1与Neh2区结合的位点，也是Keap1与胞浆肌动蛋白结合的位点［2，3］;(5)C 末端。

2 Nrf2－Keap1系统活化的机制

目前认为，Nrf2的活性主要由Keap1负性调节。在基础条件下，细胞氧化－还原内环境维持稳定，绝大部分 Nrf2以非活性状态储存于细胞质中，与Keap1相偶联，后者与胞浆肌动蛋白结合而被锚定在胞浆，通过泛素介导的蛋白降解系统维持Nrf2的基础水平;另一部分Nrf2以活性状态存在于细胞核中介导基因的基本转录。当受到亲电子物质或氧化剂作用时，通过细胞内信号通道途径，如蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K)和(或)丝裂酶原激活蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPKs)途径，Keap1感受到氧化－还原状态失衡，其半胱氨酸残基被修饰，导致E3泛素连接酶构象改变、不利于Nrf2泛素化，从而导致Nrf2发生磷酸化，与Keap1解耦联、转移入核，与其专性伴侣－肌腱膜纤维肉瘤蛋白(musculoaponeurotic fibrosarcoma protein，Maf)结合成异二聚体，识别并结合ARE，启动II相解毒酶及细胞内氧化－还原平衡蛋白基因等多种不同类型基因转录［2］。氧化－还原平衡一恢复，Nrf2与ARE序列解离，输出到胞浆，通过Cullin3依赖的E3泛素连接酶机制进行泛素化后降解，关闭Nrf2通路，重新维持低水平的Nrf2。

2.1 Nrf2与Keap1相互作用的位点 Nrf2的Neh2区存在2个不同亲和力的Kelch重复区域结合位点－ETGE模序和DLG模序。反向双杂交筛选实验显示鼠Neh2区的ETGE模序能够参与Keap1 Kelch重复区的高亲和力反应［4］。Kelch重复区和含有ETGE的Neh2合作结晶学显示Nrf2酸性肽77DEETGE82形成紧凑的β－转角结构，参与多个碱性氨基酸(第380、415和483个精氨酸，第436个组氨酸)和位于鼠及人类Keap1 Kelch重复区底部的极性氨基酸(第334、525和572个酪氨酸，第363、508和555个丝氨酸，第382个天冬酰氨酸)之间的高亲和力反应。

Neh2区与Keap1第二亲和力的位点，称为DLG模序［5］。Kelch重复区的晶体学发现其包围环绕着DLG模序，揭露了Nrf2的27DIDLGV32与Keap1 Kelch重复区的反应方式和ETGE模序相似，第26个谷氨酰氨酸、第27和29个天氨酸被结合的方式与第79个谷氨酸、第80个苏氨酸和第82个谷氨酸相似。然而，DLG肽与Kelch重复序列产生的相互静电作用比ETGE肽产生的少。

2.2 Nrf2－Keap1系统活化的机制 Keap1蛋白富含活性半胱氨酸，由于位于碱性氨基酸旁边，大约一半具有高度活性，其巯基pKa减小易于形成硫离子，与亲电子剂形成复合物或者易于被氧化。在体外烷化反应和体内定点突变实验均鉴定出只有保守的第151、273和 288个半胱氨酸(cysteine 151，273 and 288，C151、C273和C288)残基是Keap1的功能亚基，缺乏这3个半胱氨酸残基的Keap1突变体无法负性调节 Nrf2［6，7］。C151 点突变为丝氨酸的 Keap1 突变体抑制Nrf2的能力与野生型Keap1相当，但是前者不可逆地抑制了Nrf2的活化，使ARE下游基因表达减低、氧化－还原应激无法诱导，所以C151很可能是Nrf2诱导剂直接烷化的主要位点［6］。C273或C288点突变为丝氨酸的Keap1突变体可以结合Nrf2，但是无法抑制Nrf2［7］。这些数据表明C151是Nrf2通路活化所必须，而C273、C288是抑制Nrf2所必须的。我们推论这3个半胱氨酸残基可能是keap1－Nrf2感受氧化－还原状态的中心，但具体机制有待进一步研究。

2.3 Keap1抑制Nrf2的模型

①模型1:胞浆锚定模型 该模型认为在正常内环境稳态下，Nrf2与Keap1相互作用而停留在胞浆里。氧化应激时，二者解偶联，Nrf2从胞浆转移到核内。Keap1通过结合肌动蛋白而与细胞支架联合在一起支持了这个模型［3］;另一种可能是Keap1通过结合磷酸变位酶家族成员5(PGAM5)与线粒体联合［8］。因此，当亲电子试剂或氧化剂攻击时，Nrf2可能从细胞支架或者线粒体结合部位解离。

②模型2:核－浆穿梭模型 这个模型通过氧化－还原应激调节Nrf2。在正常内环境稳态下，Keap1将Nrf2保留在1个亚核隔离区，限制Nrf2的核含量，阻止与其下游基因启动子ARE序列结合;应激状态下，核蛋白前胸腺素结合Keap1的Kelch重复区域，从而释放Nrf2，激活其下游基因［9］。Nrf2的核定位信号(NLS)和核输出信号(NES)之间的平衡调节Nrf2在细胞中的穿梭运动以及Nrf2的降解。输出蛋白Crm－1可与Nrf2的NES结合，调控Nrf2进行核输出和降解。位于Neh5区内的NES有一个内源性半胱氨酸，由氧化剂或亲电子试剂修饰后，可阻止识别输出蛋白Crm－1的模序，导致Nrf2核堆积;bZIP区内的NES紧邻第568个酪氨酸，在氧化应激期间，该酪氨酸发生磷酸化，可能阻止输出蛋白Crm－1介导的Nrf2核输出［2］。也有研究认为糖原合成酶激酶－3(glycogen synthase kinase 3，GSK －3)参与Nrf2的穿梭运动。GSK－3属于保守的丝氨酸/苏氨酸激酶家族，包括GSK－3α(51 kD)和 GSK －3β(47 kD)2种亚型，目前研究主要集中在GSK－3β。GSK－3β具有广泛的细胞功能，参与细胞凋亡、新陈代谢、蛋白质翻译及基因表达;还介导Nrf2磷酸化、抑制其核转位［10］。

③模型3:泛素化降解模型 这个模型说明在正常内环境稳态下，在Keap1依赖的形式下，Nrf2不断被26S蛋白酶体降解。2004年，已证明Keap1是负责Nrf2降解的Keap1－Cullin3－Rbx1 E3泛素连接酶复合体的底物衔接蛋白［11］。在基础条件下，Keap1通过其 BTB区结合 Cullin3、Kelch区结合 Nrf2，将Nrf2连接到E3复合体，使泛素从E3转移到Nrf2的赖氨酸残基;同时，Cullin3结合ring－box1(Rbx1，也称为Roc1)，形成一个核心E3泛素连接酶复合体。从而，泛素化的Nrf2很快由26S蛋白酶体降解而保持Nrf2通路关闭。

④模型4:Nrf2基因诱导模型 Nrf2基因启动子包含ARE序列和异源物质反应元件(xenobiotic responsive element，XREs)。ARE序列对一些具有抗氧化能力的外来物反应，XRE则由转录因子芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AhR)激活，主要调节 I相代谢酶表达。3H－1，2－二硫杂环戊二烯－3－硫酮和莱菔硫烷处理后，鼠角质化细胞的Nrf2 mRNA水平增高［12］，表明Nrf2基因启动子中含有ARE序列;2，3，7，8－四氯二苯二氧芑处理后，肝癌1c1c7细胞的Nrf2蛋白和mRNA含量均增加，这与Nrf2基因启动子存在 XREs相一致［2］。

由于这些机制可能在不同的生理状态下执行，所以这4个模型不相互排斥，可以独立存在，亦可相互补充。

3 Nrf2的功能

Nrf2介导的抗氧化反应是一种主要的细胞防御机制。Nrf2缺失或激活障碍，可加重氧化应激源的细胞毒性，导致细胞功能障碍、凋亡甚至死亡。在过去20年里，有关Nrf2、氧化应激与人类不同疾病发病机理关系的研究增多，这些疾病包括:肿瘤、哮喘等呼吸系统疾病、动脉粥样硬化、神经退行性疾病和老化过程。

3.1 Nrf2活化预防和促进肿瘤

①Nrf2活化预防肿瘤作用 50多年的研究鉴定出许多来源于植物的化合物－植物化学物质，具有化学预防功能;同时也已鉴定出许多化学预防化合物是Nrf2的诱导剂。植物来源的强Nrf2诱导剂包括:莱菔硫烷(十字花科蔬菜)、姜黄素(香料)、表儿茶素酸酯(绿茶)、白藜芦醇(葡萄)、咖啡酸苯乙酯(松树)、咖啡醇和咖啡白(咖啡)、番茄红素(番茄)。除了植物化学物质外，有些合成的化学药品如奥替普拉也是强Nrf2诱导剂。这些化学预防复合物通过诱导Nrf2依赖的适应性反应，包括II相解毒酶、抗氧化剂和防止细胞随后发展成肿瘤的运载体，发挥其化学预防功能。因此，认为Nrf是一个“好”蛋白，保护人类免受致癌物质所致的遗传损伤。

许多使用Nrf2敲除小鼠的体内研究进一步证明了Nrf2在肿瘤预防中的关键作用。Nrf2敲除小鼠的II相基因如谷胱甘肽S转移酶(glutathione S－transferase，GST)、还原型辅酶Ⅰ醌类氧化还原酶［NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1，NQO1］和谷氨酰半胱氨酸连接酶(glutamate－cysteine ligase，GCL)的基础和诱导水平均减少。Nrf2敲除小鼠对化学毒物和致癌物质的敏感性增高，对肿瘤预防复合物的保护作用产生抵抗。

②Nrf2促进肿瘤 令大家惊奇的是，新的研究揭示出Nrf2也有“阴暗面”，它不仅能阻止正常细胞转化成肿瘤细胞，但在有害环境中也能促进肿瘤细胞的生长。肿瘤细胞系或者肿瘤组织通过Keap1突变或基因杂合性丢失，上调Nrf2蛋白水平及其下游基因的转录，从而促进肿瘤的生长。人体研究也表明，肺腺癌患者有高Keap1体细胞突变发生率;在乳腺癌患者中发现Keap1第23个半胱氨酸点突变损害了Keap1抑制Nrf2转录的功能，虽然其仍能与Nrf2和Cullin3相互作用，但无法有效地促进 Nrf2泛素化［13］。综上所见，Keap1功能丧失可能会导致Nrf2长期活化，上调Nrf2下游基因从而给癌细胞提供生长帮助。

另外，Nrf2诱导化学耐药也可能是促进肿瘤生长的机制。Nrf2稳定过表达能增强肿瘤细胞对顺铂、阿霉素和足叶乙甙等化疗药的耐药性，相反，使用小干扰 RNA(small interfering RNA，siRNA)干扰Nrf2后，能增加肿瘤细胞对这些化疗药物的敏感性。同样，应用小分子化学药物－特丁基对苯二酚(tertiary butylhydroquinone，tBHQ)激活Nrf2也能增强肿瘤细胞对化疗药物的耐药性［14］。

3.2 Nrf2在气道疾病中的保护作用 整个支气管气道上皮细胞衬液和组织中含有丰富的胞内、胞外抗氧化剂。由于气道首先与吸入性氧化剂接触，其氧化－还原平衡可被增强的氧化负担反复打乱。已知许多急、慢性呼吸系统疾病的发病机理与氧化应激有关，包括肺气肿/慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、哮喘、急性肺损伤(acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)、肺恶性肿瘤、特发性肺纤维化和囊性纤维化。

①肺气肿/慢性阻塞性肺疾病(COPD) 多个人类研究表明，老年吸烟者和COPD患者中肺组织和肺泡巨噬细胞中Nrf2－Keap1－Bach1平衡低下，Bach1和Keap1水平增高。相比Nrf2+/+小鼠，长期暴露于香烟烟雾(4或6个月)的Nrf2－/－小鼠，将导致更严重的肺气肿症状、氧化DNA加合物形成增多、细胞凋亡并抑制肺抗氧化酶［15］。

②哮喘和过敏性气道疾病 动物实验研究表明，Nrf2缺陷使卵白蛋白诱发的气道炎症和高反应性增强;Nrf2－/－小鼠还同时伴随显著的肺黏液细胞过度增生、嗜酸性细胞浸润、Th2细胞因子IL－4和IL－13增多以及体内多种抗氧化剂功能受抑制。暴露于环境中各种氧化剂，例如臭氧或汽车尾气颗粒(diesel exhaust particle，DEP)等颗粒物质，能引起哮喘样症状或者加重原有气道变应性疾病。DEP包含许多前氧化剂和醌、多环芳烃等致癌物质，能够诱导肺泡巨噬细胞和支气管上皮细胞1型血红素氧化酶(heme oxygenase 1，HO－1)、GST和其它 II相酶表达。研究已经阐述了Nrf2－ARE信号通路在DEP诱导的肺氧化应激和损伤中的重要性。他们发现暴露于大剂量 DEP(3 mg/m3)后，Nrf2－/－小鼠形成的DNA加合物比Nrf2+/+小鼠明显增多;暴露于低剂量DEP(100 μg/m3)后，Nrf2－/－小鼠气道高反应性以及淋巴细胞和嗜酸性细胞的炎症显著增强［16］。总的来说，Nrf2介导的抗氧化通路可决定对不同过敏原引起肺部疾病的敏感性。

③ ALI/ARDS Cho 等［17］通过对比 Nrf2+/+和Nrf2－/－小鼠对组织高氧的不同反应来证明Nrf2是ALI模型中一个候选易感基因。相比野生型小鼠，Nrf2－/－小鼠肺高通透性、炎症浸润和上皮损伤增强;与Nrf2－ARE通路在高氧引起的肺毒性中的保护作用一致，Nrf2－DNA结合活性和多种抗氧化酶(如GST、NQO1、GCL、HO － 1)的表达在 Nrf2－/－小鼠中明显减弱。在高潮气量机械通气引起的呼吸机相关性肺损伤(ventilator－induced lung injury，VILI)小鼠模型中发现，与Nrf2+/+小鼠相比，Nrf2－/－小鼠肺泡和血管通透性以及VILI相关的前炎症因子水平升高，ARE反应性谷胱甘肽合成酶水平减少，氧化－还原平衡破坏［18］。调查人员还发现小鼠Nrf2在实验性颅脑损伤所致的ALI中发挥调节作用。通过中度体重下降诱发小鼠脑损伤，与 Nrf2+/+小鼠相比，Nrf2－/－小鼠肺毛细血管通透性、湿/干重比和肺泡细胞凋亡加剧;肺损伤加重与炎症因子(TNF－α、IL－1β、IL－6)表达增多和肺抗氧化和解毒酶(NQO1、GST)减少有关［19］。

④弥漫间质性肺纤维化 Nrf2介导的抗氧化通路是限制博来霉素诱导的肺纤维化所必须的。已经阐明了ARE下游的抗氧化酶在实验性纤维化中的保护作用。通过给予多酚表儿茶素酸酯活化Nrf2－ARE反应可以减轻博来霉素诱导的大鼠肺损伤和炎症［20］。尽管没有明确的证据证明Nrf2在人纤维化患者中的作用，但是观察到IPF患者肺中Nrf2表达伴随着氧化剂标记增多，这说明二者是有关联的。

3.3 Nrf2参与动脉粥样硬化 氧化应激和炎症是促进动脉粥样硬化斑块形成的2个关键因素。Dai等［21］使用siRNA技术抑制血管内皮细胞Nrf2表达，同时联合全基因组转录谱，确定Nrf2是改变血管内皮细胞氧化－还原平衡的一个关键性决定因素。在2种标准动脉切应力下培养人血管内皮细胞，并从经典的动脉粥样硬化模型2个不同血管区域－“易感”区和“耐受”区中分离出动脉粥样硬化保护剂－氯贝丁酯，从而证明“动脉粥样硬化保护”流通过磷酸酰肌醇激酶(PI3K)/Akt通路差异激活小鼠主动脉粥样硬化“耐受”区和“易感”区的Nrf2及其下游转录因子，来维持血管内皮细胞内氧化－还原平衡、减轻氧化应激所致的损伤。

但是，Sussan 等［22］将 Nrf2－/－小鼠与载脂蛋白 E缺陷 (ApoE－/－)小鼠杂交，同时予 ApoE－/－和ApoE－/－Nrf2－/－小鼠致动脉粥样硬化的饮食 20周，最终在主动脉形成粥样硬化斑块。与ApoE－/－小鼠相比，ApoE－/－Nrf2－/－小鼠形成的斑块面积明显减小(29.5% 比 11.5%)，而且，斑块面积减少与ApoE－/－Nrf2－/－小鼠巨噬细胞摄取修饰后低密度脂蛋白的量显著减少有关;后来，从 ApoE－/－Nrf2－/－小鼠分离的巨噬细胞和动脉粥样硬化斑块中发现清道夫受体－分化抗原簇36(cluster of differentiation 36，CD36)表达减少。以上表明，尽管Nrf2有抗氧化功能，但其在小鼠体内是一个促动脉粥样硬化剂，这个促进作用可能通过阳性调节CD36分子介导。总之，Nrf2在动脉粥样硬化中的作用仍需进一步研究，以帮助制定有利于预防动脉粥样硬化斑块形成的治疗策略。

再者，活化的Nrf2也可抑制血管平滑肌细胞增殖;保护缺血－再灌注损伤对心肌细胞的损害。

3.4 Nrf2对急性神经损伤、神经退行性变、大脑缺血等有保护作用 体内外模型均显示Nrf2－ARE通路能有效阻断由于谷胱甘肽消耗、脂质过氧化、胞内钙超载、神经兴奋性毒素和线粒体电子传递链断裂而致的神经毒性，而且还能增加神经元能量和氧化－还原电位、抑制性神经递质信号和代谢过程。星形胶质细胞－运动神经元共培养实验数据表明星形胶质细胞分泌的谷胱甘肽是Nrf2活化后产生神经保护作用的一个主要组成部分，它由谷氨酸－半胱氨酸连接酶(GCL)和谷胱甘肽合成酶(GSH)连续作用合成，GCL催化亚基(glutamate cysteine ligase catalytic subunits，GCLC)和修饰亚基(glutamate cysteine ligase modulatory subunits，GCLM)组成了 GSH合成的限速酶复合物，Nrf2活化后GCLC和GCLM的表达均增多。与神经元相比，星形胶质细胞中优先活化的Nrf2使GSH合成更有效、含量更高，其分泌的GSH通过作为细胞外抗氧化剂和/或通过增加GSH合成前体利用率提高神经元GSH水平来保护神经元［23］。

此外，转录因子Nrf2还与炎症、自身免疫性疾病、糖尿病、慢性肾功能衰竭等其它人类疾病的发病、预防有关。

总之，普遍表达于各种细胞的转录因子Nrf2介导的细胞防御机制在对抗各种环境应激和内源性应激的反应中发挥重要作用，是参与肿瘤预防、肿瘤耐药、哮喘、COPD、神经和血管保护的重要效应分子。因此，我们应深入研究 Nrf2，阐明 Nrf2－Keap1－ARE通路对不同氧化应激反应的确切调控机制，阐明功能受损的Nrf2－Keap1系统与人类不同疾病之间的相关性，利用该通路作为疾病预防控制以及治疗策略的靶点，为人类健康造福。

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