畜牧兽医科技文摘

鹅细小病毒基因组结构特征研究进展/朱海侠（福建省农业科学院畜牧兽医研究所），万春和，黄瑜//中国动物传染病学报.-2011,19(1).-81～82

鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)属细小病毒科,细小病毒属,由我国学者方定一1956年首次分离报道。GPV基因组约5 Kb,由左右2个完整的开放阅读框(open reading frame,ORF)组成:LORF(left ORF)和RORF(right ORF)。LORF编码非结构蛋白(nonstructural protein,NS)NS1和NS2,RORF编码VP1、VP2和VP3三种结构蛋白。本文针对近年来鹅细小病毒基因组结构特征的研究进展进行了综述。

柔嫩艾美耳球虫抗药性相关基因M20的克隆与表达/程军（上海师范大学生命与环境科学学院），董辉，郭涛等//中国动物传染病学报.-2001,19(1)-62～67

利用前期构建的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株与各自母株之间的抑制性消减文库而获得的ESTs序列,选择其中一个差异表达的EST序列(克隆号为M20),采用RACE技术,以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA为模板,扩增获得了该基因的全长cDNA序列,命名为M20,该基因全长847 bp,包括一个525 bp的开放阅读框,编码174个氨基酸,预测理论分子量约为19 ku。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在敏感株中表达量高于地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株;在不同发育阶段中,未孢子化卵囊表达量高于孢子化卵囊、子孢子以及裂殖子阶段虫体。将该基因克隆于原核表达质粒pET28b中,构建重组质粒pET28b-M20,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导表达获得了重组蛋白,分子量约约为23 ku,该蛋白以包涵体形式存在,在IPTG诱导8h后表达稳定,Western blot检测表明,其具有较好的免疫原性。

羊种布氏菌体外药物敏感性分析/姜海(中国疾病预防控制中心传染病预防控制所),崔步云,赵鸿雁等//中国人兽共患病学报.-2011,27(4).-325～326，330

目的了解羊种布氏菌对常用抗生索的耐药情况及耐药机制。方法用微量稀释法对国内分离的69株羊种布氏菌进行12种抗生素(阿奇霉素、克拉霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、多西环素、利福平、头孢曲松、复方新诺明、链霉素)的耐药检测。结果除了阿奇霉素和克拉霉素外,所有羊种布氏菌对另外10种抗生素均敏感。所有菌株23SrRNA都具有单核苷酸多态性2632 T/C。结论 23SrRNA转肽酶中心点突变是羊种布氏菌耐大环内酯类耐药的机制之一。尽管布氏菌耐药尚未对布病防控构成威胁,但还需开展耐利福平监测工作。

志贺氏菌病发病机制的研究进展/康静静（河南农业大学牧医工程学院），杨玉荣，梁宏德//中国农业科学.-2011,44(9).-1939～1944

志贺氏菌也称痢疾杆菌,属于革兰氏阴性细胞内致病菌,主要侵害结肠,引发炎症并形成溃疡,可引起频繁的粘液性血性腹泻,儿童和幼龄动物有较高的感染率和死亡率。目前志贺氏菌病的临床治疗很困难,对志贺氏菌病发病机制的研究可为临床治疗提供理论依据,本文从志贺氏菌的胞内入侵机制、分子机制和免疫机制等方面概述志贺氏菌病发病机制的研究进展。

抗犬Ⅰ型腺病毒单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定/李晓叶(吉林大学畜牧兽医学院),刘颖,蓝田丰等//中国农学通报.-2011,27(11).-31～34

为制备抗犬I型腺病毒单克隆抗体,将犬I型腺病毒(CAV-I)细胞培养液饱和硫酸铵沉淀,差速离心浓缩,氯化铯密度梯度离心的方法纯化后免疫BALB/c小鼠,三免后效价过1:10000即可取脾细胞与SP2/0细胞在聚乙二醇(PEG)作用下融合,通过间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,有限稀释法亚克隆,制备单克隆抗体,并对制备完成的单克隆抗体进行生物学特性鉴定。获得2株能稳定分泌抗CAV-I的单克隆抗体杂交瘤细胞,命名为C8、E9,经鉴定其亚型分别为IgG1和IgG2a。间接ELISA检测效价,2株单抗细胞上清液效价为1:3200～1:6400,腹水效价为1:25600～1:51200。该单克隆抗体与CDV、FPV、FCV病毒均无交叉反应。实验成功制备了抗CAV-I单克隆抗体,为进一步建立相关诊断方法奠定了基础。

犬细小病毒VP2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达与检测/毕聪明（辽宁医学院畜牧兽医学院），费东亮，陈强等//中国农学通报.-2011,27(7).-352～355

为表达犬细小病毒VP2蛋白(CPVVP2),用于犬细小病毒病的诊断、疫苗研制和VP2蛋白功能研究,根据基因库已发表犬细小病毒序列设计合成了VP2基因的1对特异引物,以细小病毒感染的犬粪样品中提取的总DNA为模板,进行PCR扩增,把扩增产物克隆至pMD18-T载体进行测序、鉴定。将克隆的VP2基因片段克隆至原核表达载体PGEX-6P-1,再将构建成功的原核表达质粒载体PGEX-6P-VP2转化至大肠杆菌BL21中,进行鉴定、测序、表达。结果表明,克隆的VP2基因片段全长1755bp,与6个VP2基因序列的同源性为98.7%～99.7%。Western-blotting分析显示,表达产物约为90kD的融合蛋白,可被犬细小病毒阳性血清所识别,具有良好的反应原性。

鸡传染性支气管炎病毒HN104株的鉴定及S1基因的分子特征/刘文杰(河南农业大学牧医工程学院),王忠田,李新生等//中国农学通报.-2001,27(7).-343～347

2010年4月从河南省某疑似患鸡传染性支气管炎鸡场中分离到一株病毒。通过SPF鸡胚致侏儒实验,鸡红细胞凝集试验,干扰新城疫病毒增殖试验和RT-PCR试验确认该病毒为一变异的鸡传染性支气管炎病毒。该病毒尿囊液凝集鸡红细胞的HA价为0,经胰酶处理后为27;EID50(鸡胚半数感染量)为10-5.5/0.1mL;能够显著干扰鸡新城疫病毒LaSota株在鸡胚中的增殖;动物回归试验结果显示该病毒可致SPF雏鸡出现肾脏肿大,呈花斑肾。其S1基因全长为1617bp,经序列分析发现与鸡传染性支气管炎疫苗Massachusetts株、T株、4/91株亲缘关系较远低于78%。

绵羊痘病毒RPO30基因的克隆及序列分析/赵志荀(甘肃农业大学动物医学院),吴国华,颜新敏等//中国农学通报.-2011,27(7).-304～308

选择羊痘病毒RNA聚合酶RPO30进行分析,为进行RNAi羊痘病毒研究,进行目的基因的初步筛选。PCR扩增RPO30基因,连入pMD18-T simple载体并转化DH5a大肠杆菌。经蓝白斑筛选挑选白斑制备质粒,经双酶切、PCR及测序鉴定。结果成功克隆了RPO30基因,克隆的SSPV RPO30基因ORF为585bp,编码193个氨基酸,阅读框内有一个HindIII酶切位点,测序结果与Gen Bank数据库中不同痘病毒毒株之间同源性存在着明显区别。进一步经过生物学软件分析表明RPO30蛋白质氨基酸4—12、18—26、50—61、68—92,176—190位之间区域形成活性中心的可能性较大,选择这些区域进行作用可能会造成该基因产物酶的失活,从而高效抑制病毒的复制。

宁波市狂犬病病毒NB0901株核蛋白基因的序列分析/易波(宁波市疾病预防控制中心传染病防制所);倪红霞;方挺等//中国媒介生物学及控制杂志.-2011,22(2).-148～150

目的通过RT-PCR方法对2009年宁波市狂犬病病毒分离株(NB0901)的N基因扩增并测序,了解宁波地区狂犬病病毒的流行特点。方法运用RT-PCR方法和序列测定方法获得NB0901株的N基因序列,并在核苷酸和氨基酸水平与疫苗株(3aG和CNT-1)进行同源性比较,同时进行遗传进化分析。结果狂犬病病毒NB0901株与疫苗株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别在86.6%～90.1%和95.5%～98.8%之间。NB0901株N蛋白的抗原表位与疫苗株相比后发现在NⅠ和NⅡ抗原表位存在突变。而在Th细胞表位上,NB0901株与CNT-1株完全一致,与3aG株相比变异较大。进化结果表明NB0901株属于狂犬病病毒Ⅰ群中的A亚型。结论狂犬病病毒NB0901株和当前疫苗株虽同属于Ⅰ群,但是与疫苗株相比存在差异,从氨基酸序列水平上分析,CNT-1株较3aG株更能有效保护流行毒株感染。

猪脑心肌炎病毒NJ08株基因组序列测定与分析/白娟(南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室)蒋康富,李玉峰等//中国预防兽医学报.-2011,33(5).-402～404

为测定猪源脑心肌炎病毒(EMCV)NJ08分离株全基因序列,本研究应用RT-PCR方法分5个基因片段扩增NJ08分离株的基因组,同时应用3'-RACE和5'-RACE技术扩增3'-UTR和5'-UTR,分别克隆于pMD18-T载体中进行测序,获得EMCVNJ08株全基因组cDNA序列,并将全基因组及其推导的氨基酸序列与GenBank中登录的国内外参考病毒株进行同源性比较及系统进化分析。结果表明:EMCVNJ08分离株基因组全长7724bp;属于Ia亚群;与GXLC、GX0602、BJC3、HB1等国内分离株以及BEL-2887A、CBNU、K3、K11、EMCV-R、PV21等国外分离株同源性达99%以上;EMCV流行株的非结构蛋白中3D最为保守,2A变异最大,结构蛋白中VP2最为保守,VP1变异最大。本研究丰富了我国EMCV分子流行病学资料。

我国部分地区蛋鸡ALV-J分离株gp85基因遗传进化分析/潘伟(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室),高玉龙,刘超男等//中国预防兽医学报.-2011,33(5).-399～401,414

为了解我国蛋鸡J亚型白血病病毒(ALV-J)株来源及其遗传进化关系,本研究对2009年从我国6个省区蛋鸡场分离到的19株ALV-J的gp85基因进行克隆和测序,并与11个ALV-J参考株gp85基因作了比较分析。结果表明:19个ALV-J分离株的gp85基因长度为894bp～924bp不等,分别编码298～308个氨基酸;各病毒株间gp85推导氨基酸的同源性为71.3%～100%。遗传进化分析表明,目前我国蛋鸡ALV-J分离株来源复杂,其中13个分离株与英国原型株HPRS-103、国内麻黄肉鸡株SCAU-0901亲缘关系较近;3个分离株与美国株ADOL-7501及国内白羽肉鸡株HN0001处在同一大的分支;而另外3个分离株则各自形成独立的分支,表明其gp85基因发生了较大变异。本研究表明,19个分离株与国内早期肉鸡分离株亲缘关系较远,提示我国当前蛋鸡ALV-J株可能并非源自国内早期肉鸡ALV-J株,其来源有待进一步研究。

牛肠道病毒的分离鉴定/李英利(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室),常继涛,于力//中国预防兽医学报.-2011,33(5).-388～390

本研究从内蒙古某奶牛场的犊牛粪便样品中分离的一株牛肠道病毒(BEV),命名为BHM26,通过电镜观察显示和分子生物学鉴定,发现病毒粒子在细胞浆中呈结晶状排列,单一病毒粒子呈典型小RNA病毒粒子形态,直径为25nm～30nm,无囊膜;病毒的部分3D蛋白编码区和全长3'UTR区段的1026bpDNA片段的RT-PCR扩增和序列分析表明,其核苷酸序列与GenBank登录的参考病毒株核苷酸序列同源性为71.9%～87%,其中与BEVWye-3A株同源性最高,为87%。分析表明中国BEV分离株与国外参考毒株具有较大差异。

抗猪伪狂犬病病毒gH抗体的制备及gH在感染细胞中表达分析/刘庆伟(中国农业科学院上海兽医研究所兽医公共卫生实验室)，邱亚峰，王晓杜等//中国预防兽医学报.-2011,33(5).-383～387

为检测伪狂犬病病毒(PRV)在体外细胞中糖蛋白H(gH)的表达情况,本研究构建原核表达重组质粒pET-gHN660,并在大肠杆菌中诱导表达重组蛋白,纯化的gH重组蛋白免疫实验动物制备抗PRVgH抗体,经westernblot和IFA检测到病毒感染细胞中gH蛋白的表达,病毒感染细胞后表达的gH蛋白大小为95ku,定位于细胞浆中,gH蛋白在病毒感染细胞4h可以检出,随PRV的复制gH蛋白表达增加,gH蛋白可以作为PRV复制的指示蛋白。本研究利用制备的抗体分析感染细胞中gH蛋白的表达情况,初步探讨感染细胞中PRV的复制,为PRV和宿主相互作用的研究奠定基础。

猪白细胞介素-2在BHK-21细胞中表达及其活性分析/王大伟(石河子大学动物科技学院),乔军,张辉等//中国预防兽医学报.-2011,33(5).-378～382

为鉴定BHK-21细胞中稳定表达猪白细胞介素-2(PoIL-2)的活性,本研究利用RT-PCR技术从猪的淋巴细胞中克隆PoIL-2基因,将其连接于pcDNA3.1载体中,并转染BHK-21细胞。经过G418筛选及RT-PCR鉴定,获得稳定表达PoIL-2基因的BHK-21细胞系。采用实时定量PCR及ELISA测定PoIL-2在BHK-21细胞内的表达,同时以淋巴细胞增殖试验(MTT)检测PoIL-2蛋白活性。试验结果表明稳定整合PoIL-2基因的BHK-21细胞系其PoIL-2mRNA的转录效率是阴性对照组1.43倍,蛋白表达量是阴性对照组1.29倍。MTT试验表明真核表达的PoIL-2促淋巴细胞增殖活性与阴性对照组相比差异极显著(p<0.01),表明BHK-21细胞表达的PoIL-2具有良好的生物学活性。本研究为开发新型基因工程疫苗佐剂和抗病毒制剂奠定了基础。

狂犬病病毒糖蛋白在Bac-to-bac杆状病毒系统中的表达及应用/范晓娟(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室),李刚,李伟等//中国预防兽医学报.-2011,33(5).-366～369

为表达狂犬病病毒(RV)糖蛋白(G),本研究通过RTPCR方法克隆RVFluryLEP病毒株G基因,将其克隆至质粒pFastBacHTα中,重组质粒pFastBac-RV-G转化DH10Bac感受态细胞,经同源重组获得重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-RV-G,将其转染昆虫细胞sf21获得含有G基因的重组杆状病毒。采用SDS-PAGE和westernblot对重组蛋白进行鉴定及抗原性分析,以重组G蛋白作为包被抗原的ELISA检测36份犬血清样品。结果表明,在Bac-to-bac杆状病毒系统中表达的RVG蛋白能与histag单克隆抗体及RV阳性血清发生特异性反应,其相对分子量为60ku;与以RV为包被抗原的商品化ELISA试剂盒相比,以重组RVG蛋白为抗原建立的间接ELISA的敏感性、特异性和符合率分别为80%、81.8%和80.6%,表明杆状病毒系统表达的RVG蛋白是检测RV抗体的理想抗原蛋白,作为一种亚单位疫苗具有潜在的应用前景。

稳定表达T7RNA聚合酶PK-15细胞系的建立/黄俊华(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室)，贺番，孙元等//中国预防兽医学报.-2001,33(5).-358～361

为构建稳定表达T7RNA聚合酶(RNAP)的猪肾细胞系(PK-15),本研究采用PCR方法,以E.coliBL21(DE3)细菌基因组为模板扩增T7RNAP基因,将其克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒pLXSN-T7。采用脂质体将pLXSN-T7转染至PT67细胞中,经G418筛选培养获得重组逆转录病毒rMLV-T7,将其接种于PK-15细胞进行G418加压筛选和纯化;应用PCR、间接免疫荧光试验及T7启动子控制下的红色荧光蛋白的重组表达质粒(pET-RED)进行瞬时表达,检测T7RNAP的表达及活性,结果表明筛选所得的细胞系PK/T7的不同代次均具有转录活性。本研究建立稳定表达T7RNAP的细胞系PK/T7,为实现细胞内T7启动的转录和猪源RNA病毒等的反向遗传操作提供了有效的方法。

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60与兔肝脏细胞中相互作用蛋白的初步筛选/穆亚芳(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/实验动物研究室)，刘家森，郭东春等//中国预防兽医学报.-2001,33(5).-354～357

为鉴定兔出血症病毒(RHDV)在感染兔肝脏过程中与肝细胞膜表面相互作用的靶蛋白,本研究利用SMART文库构建技术构建了兔肝脏细胞的真核表达cDNA重组质粒文库,将其转染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选表达兔肝细胞蛋白的阳性SP2/0细胞。以RHDV-VP60蛋白作为固相包被抗原,经筛选,获得能够与VP60蛋白相互结合的表达性阳性SP2/0细胞克隆。测序表明26个克隆与兔的一些功能性蛋白有较高的同源性,其中包括代谢酶类13个、免疫信号通路受体蛋白5个以及其他细胞膜蛋白等。本研究鉴定的与RHDVVP60具有结合性的细胞蛋白为RHDV感染机制的研究奠定了基础。

鸡传染性支气管炎病毒ck/CH/LHB/100801株的分离鉴定及分子特征研究/马会杰(东北农业大学),刘孝珍,韩宗玺等//中国预防兽医学报.-2011,33(5).-348～353

本研究于2010年8月从河北省某鸡场鸡群中分离一株病毒,通过对分离株进行电子显微镜观察、鸡胚致病性试验、血凝特性试验等生物学特性及鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白基因RT-PCR方法鉴定,结果表明分离株为IBV,命名为ck/CH/LHB/100801。根据GenBank中登录的IBV基因组序列,设计扩增病毒全基因组的19对引物,并扩增病毒基因组,采用3`-RACE和5`-RACE技术,扩增得到该病毒全部基因组序列。通过与已发表的参考病毒株全基因组序列比较表明,该分离株基因组全长为27675bp,共有10个开放阅读框,其基因排序为:5'-cap-Replicase-S-3a-3b-3c-M-5a-5b-N-poly(A)-3',纤突蛋白裂解位点为534RRFRR538。序列分析表明ck/CH/LHB/100801与台湾分离株TW2296/95的结构蛋白序列相似性高达99.8%,进化亲缘关系最近,推测两分离株间可能具有相同的进化来源。

禽源U6启动子介导鸡马立克氏病病毒gI、gE基因特异siRNA的筛选及干扰活性鉴定H5亚型禽流感疫苗变异候选株的构建/张文俊(扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室),薛涛,吴小伟等//中国家禽.-2011,33(8).-14～18

本文就2008年在江苏某鸡场分离到的一株发生抗原变异的H5N1亚型禽流感病毒A/chicken/Huadong/4/2008(wt-DT株)开展如下研究:利用反向遗传技术,删除wt-DT株病毒血凝素(HA)基因多碱性氨基酸序列,使之成为低致病特征,再与wt-DT株的神经氨酸酶(NA)基因组合,结合鸡胚高产病毒PR8株的6个内部片段骨架,构建针对此种变异H5亚型禽流感的疫苗株,结果成功拯救出重组病毒rH5N1/PR8。病毒在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖能力,相对于wt-DT株,rH5N1/PR8在MDCK细胞上的繁殖能力明显提高。rH5N1/PR8对SPF鸡和鸡胚无致病性,在鸡体内的免疫保护效果良好,符合疫苗候选株的标准。

泊洛沙姆—辛酸法对鸡卵黄脱脂条件的研究/张伦(河北农业大学动物科技学院),高轩,李明义//中国动物检疫.-2011,28(3).-49～51

本文就泊洛沙姆浓度、辛酸浓度、泊洛沙姆沉淀法沉淀离心条件对泊洛沙姆-辛酸法对鸡卵黄脱脂的影响进行了探讨。实验结果表明:泊洛沙姆浓度、辛酸浓度分别对卵黄脱脂存在不同程度影响,卵黄稀释液沉淀离心条件对卵黄脱脂影响不大。蛋黄稀释液不经离心直接纱布过滤,辛酸浓度为0.2%,泊洛沙姆浓度分别为0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%的7个处理中,以1.2%浓度的提取效果最好;泊洛沙姆浓度为1.2%,辛酸浓度为0.2%,蛋黄稀释液经离心处理和纱布过滤处理对卵黄脱脂影响不大;泊洛沙姆浓度为1.2%,蛋黄稀释液纱布过滤处理,辛酸浓度分别为0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的6个处理中,以0.2%浓度的提取效果最好。