活性氧与内质网应激

周映彤，肖洪彬，毕明刚

(1.黑龙江中医药大学药理毒理研究中心，黑龙江哈尔滨 150000;2.中国医学科学院药用植物研究所，北京 100193)

内质网(endoplasmic reticulum，ER)是一个膜性细胞器，广泛存在于真核细胞中，是细胞内重要的细胞器，是调节蛋白质合成及合成后折叠、聚集的场所，是调节细胞应激反应的场所，同时也是调节Ca2+稳态水平和Ca2+信号转导的主要部位。一些错误折叠或未折叠蛋白在ER内积累或Ca2+稳态的破坏均可引起ERS［1－4］。正常情况下，ER内环境的稳定是实现ER正常功能的保证，作为一种亚细胞水平上的保护性手段，ERS早期通过诱导未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)，使蛋白质的生物合成减少，ER的降解功能增强，从而降低ER负担，维持细胞内的稳态，是一种促生存响应。随着ERS加剧，UPR的激活被抑制，引起ER摄取/释放Ca2+障碍或蛋白质加工/运输障碍，信号就会由生存向凋亡转换，激活了ERS特异性的促凋亡转录因子CHOP的表达，进而抑制AKT的活性，促进了细胞凋亡。因此，UPR和Ca2+起始信号构成了ERS介导的细胞凋亡的两种主要作用机制［5］。

ROS作为细胞内级联信号的调节者，其产生与清除之间的平衡对维持细胞的氧化还原状态非常重要，ER正常的生理功能与氧化还原状态密切相关，越来越多的研究表明ROS在多种药物诱导的ERS过程中起着介导和调节作用，可能作为ERS介导的细胞凋亡途径的上游信号［6］，其与ER UPR和ER Ca2+之间相互作用的机制备受关注，该文就ROS与ERS之间的关系作一综述。

1 ROS的生理机制

ROS是生物体内的氧自由基，包括氧和含氧的高反应活性分子(如超氧化物阴离子、组织过氧化物和自由基等)，作为细胞内和细胞间的第二信使ROS调节许多信号分子。ROS主要来源于线粒体，是线粒体由状态III向状态IV转换中高氧的环境和高还原态的呼吸链使大量电子漏出并还原氧分子而形成。Lewen等［7］在小鼠缺血缺氧细胞模型中证实有ROS的产生，ER腔内蛋白被氧化修饰，因此ER可能是ROS攻击的重要目标之一。近有研究，ER上ROS的产生是通过NADH－细胞色素P450还原酶将电子传递给O2形成O2－·，在NADH的辅助下，核膜上的电子传递链将电子传递给O2，便产生了ROS。ROS的产生与清除之间的平衡对维持细胞的氧化还原状态非常重要，细胞内氧化还原状态的改变促进了氧自由基的产生和凋亡诱导因子的激活，致使细胞凋亡的同时又加剧了细胞内氧化还原状态的改变，进而影响细胞的生理状态，启动了氧化应激，触发细胞凋亡信号的激活，而Ca2+平衡失调、氧化应激等也是诱发ERS的重要因素。

2 ROS与UPR

2.1 ROS诱导产生的UPR及其促生存途径 ER的主要功能就是通过折叠酶和分子伴侣的作用使新合成的蛋白达到正确的折叠构象并有效的进入分泌途径，为蛋白的折叠提供一个独特的氧化环境。生理情况下，介导UPR产生的3个ERS感受蛋白PERK、ATF6、IRE1，分别与ER分子伴侣GRP78(glucose-regulated protein 78)结合处于无活性状态。ROS可以直接攻击维持蛋白折叠酶活性所必须的游离巯基，使得ER腔内蛋白质被氧化修饰，进而诱导ER折叠酶或分子伴侣的功能异常而引起未折叠蛋白的积累，并滞留于ER腔内，触发了ERS。与此同时，ERS标志性分子伴侣蛋白GRP78的表达明显增加并从3种跨膜蛋白上解离，转而去结合未折叠蛋白，以增强ER蛋白质折叠能力，减少蛋白质在ER的堆积。与GRP78解离后的ERS感受蛋白随之被激活进而触发了UPR的产生，并通过限制非折叠蛋白的合成，加强ER对蛋白的折叠能力，加速非折叠蛋白的降解等方式减轻了ER的负荷压力，触发了其各自诱导的促生存响应。其中，由PERK激活的抑制蛋白质的翻译与合成的促生存途径，通过限制非正常折叠蛋白质进人ER，降低ER对新蛋白质折叠需求的压力，作为第一道防线捍卫了细胞的生存［8－10］。应用ROS抑制剂MnSOD的模拟物MnTMPyP可抑制ERS中ROS的增加，进而延缓UPR的激活，由此提示，ROS是触发ERS介导的凋亡通路的上游信号分子，启动了ERS介导的细胞凋亡［6］。而Tu等［11］发现ER中存在的蛋白二硫键异构酶是具有酶活性的分子伴侣。UPR早期阶段，蛋白二硫键异构酶合成增加，促使错误折叠的蛋白质形成正确的二硫键，同时产生一个电子，而细胞中的GSH(还原型谷胱甘肽)与氧则作为最终的电子受体，导致细胞中ROS水平升高，GSH被氧化成GSSG(氧化型谷胱甘肽)。此途径可作为除线粒体来源之外ROS产生的另一个重要来源。应用GSH抑制剂使得蛋白二硫键异构酶介导的酶促反应停顿，更多未折叠蛋白无法重新正确折叠，信号就会由促生存向促凋亡转换，进而触发了ERS介导的细胞凋亡。UPR作为一种细胞水平上的保护性手段可降低未折叠或错误折叠蛋白在ER内的积累，因此ERS早期，ER主要是通过激活UPR以保护由ERS所引起的细胞损伤，恢复ER的正常功能，使之存活，是一个促生存响应［12］。

2.2 TNF-α诱导产生的ROS与UPR之间的相互作用 肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)作为一种多效能的细胞因子，可诱导细胞分化、基因转录、存活以及细胞凋亡，同时也可通过调节细胞的还原状态，特别是内源性ROS的改变来介导细胞内的信号。薛辛等［13］用TNF-α刺激小鼠成纤维细胞L929后，导致细胞内ROS的水平明显升高和细胞凋亡。进一步研究发现TNF-α作用于L929可以诱导ERS及ERS标志性蛋白GRP78和UPR中的关键分子X盒结合蛋白1(X box binding protein1，XBP-1)表达的明显升高，使用NAC可延缓UPR的激活和细胞凋亡。由此提示，TNF-α可能是通过诱导ROS水平的升高，进而触发了ERS及UPR。TNF-α与过氧化氢等其他诱导因素不同，TNF-α诱导的氧化应激不仅可以触发eIF2α的磷酸化，同时可激活PERK-或IRE1-所依赖的信号传导通路。Xue等［14］发现ERS诱导剂衣霉素(tunicamycin)诱导产生的UPR可通过阻断细胞内谷胱甘肽水平的降低来抑制由TNF-α所诱导的ROS产生和细胞凋亡。应用tunicamycin(2 mg·L－1)刺激正常细胞，几乎不能明显诱导ROS的生成，而用同样方法处理PERK-和ATF4-敲除的细胞，细胞内ROS的水平则明显高于正常细胞。可见，早期UPR作为一种自身代偿过程，其正常功能可对抗由ERS本身或TNF-α等各种应激诱导的ROS积累，进而发挥其维持细胞正常功能促进细胞生存的作用。然而，随着ERS加剧，ER损伤太过严重以致内环境稳定不能及时恢复，UPR的激活受到抑制，其诱导产生的抗氧化活性不能抵抗强烈的ERS，导致ROS水平的明显升高，信号就会由促生存向促凋亡转换，进而触发了ERS介导的细胞凋亡。

3 ROS与ER Ca2+

3.1 ROS对ER Ca2+诱导的ERS的调节 自从Kaiser等发现糖皮质激素诱导的胸腺细胞凋亡与Ca2+内流增加有关以来，越来越多的直接或间接证据表明胞质Ca2+浓度上升是细胞凋亡的一个重要事件。作为细胞内最主要的Ca2+库，ER正常的生理功能与细胞内Ca2+以及氧化还原状态密切相关，推测氧化还原状态的改变以及ROS的存在影响了ER上的通道功能，进而影响到Ca2+平衡。在亚硝酸钠(抗肿瘤药物)诱导的ERS介导的人急性早幼粒白血病NB4细胞凋亡的研究中发现，应用ROS抑制剂部分抑制了亚硝酸钠引起的细胞内Ca2+的升高，提示ROS参与了亚硝酸钠诱导的ERS介导的细胞凋亡［6］。应用鱼藤酮作用于肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞发现［15］，鱼藤酮刺激可引起ER的大量增生，ER膜发生脂质氧化损伤，其渗透性明显增加，通过耗竭ER Ca2+，引起细胞质游离Ca2+的增加进而诱发ERS和细胞凋亡，且不同浓度的鱼藤酮均能诱导细胞内ROS的大量产生，应用抗氧化剂SOD后，鱼藤酮诱发的Ca2+升高作用明显减弱，提示鱼藤酮所致的细胞内游离Ca2+的升高是通过ROS激发的。但也有研究表明凋亡早期贮存于ER的Ca2+释放引起胞内Ca2+水平轻度升高，并协同其它因素(如GSH的下降等)引发线粒体大量产生ROS，而ROS进一步促进胞内Ca2+浓度持续升高。虽然其中的具体机制尚未明确，但ROS的产生堆积和ER Ca2+水平的升高都是ERS介导的细胞凋亡中的重要事件，且两者相互促进，在细胞凋亡中发挥重要作用。

3.2 ROS对IP3R及RyR介导的ER Ca2+释放的调节ROS作为调节Ca2+转运活性的氧化还原信号分子，其选择性氧化修饰ER Ca2+调节蛋白的特定位点是其影响ER Ca2+信号的重要机制。维持ER内Ca2+稳态的是ER上的3种与Ca2+的摄入和释放相关的通道:①向胞质内释放Ca2+蓝尼啶受体(ryanodine receptor，RyR)和1，4，5-三磷酸肌醇受体(inositol-1，4，5-triphosphatereceptor，IP3R);②将Ca2+转运至ER中的Ca2+泵(Ca2+-ATPase)或肌浆网Ca2+泵(sarcoplasmic-endoplasmic-reticulum Ca2+-ATPase，SERCA);③ER腔内的钙结合蛋白(钙网膜蛋白/calreticulin、钙联蛋白)［16］。研究证实肌浆网上分布的IP3R和RyR可被氧化还原反应调控。ER中含有NADPH氧化酶(含膜结合催化亚基和胞质侧调节亚基)的NOX亚型，并且和钙联接蛋白(calnexin)及钙网蛋白(calreticulin)共存。NOX亚型含有主要的催化亚基gp91phox(NOX2)，其产生的ROS主要参与细胞信号转导。虽然ER中NOX表达的意义还未明确，但最近的研究提示［17］NOX1和NOX4可以与PDI(蛋白质二硫键异构酶)作用，即线粒体之外的ROS也可能调节ER功能。

3.2.1 ROS对IP3介导的ER Ca2+释放的调节 进一步研究表明［16－17］ER内NADPH氧化酶的激活能提高人内皮细胞ER对IP3的敏感性，NADPH氧化酶源性的ROS可直接作用于ER上分布的大量IP3R，引起其构象改变，细胞外Ca2+内移和细胞内Ca2+存储结构的释放，导致ER Ca2+库开放该通道，致使胞质游离Ca2+浓度升高，启动胞内Ca2+信号系统，通过Ca2+调节依赖的蛋白激酶II活性的变化来调控一系列生物学效应。

3.2.2 ROS对RyR介导的ER Ca2+释放的调节 静息状态下，细胞内环境是高度还原态的，而局部氧化还原电位的升高是细胞重要功能的触发点。研究发现［18］肌浆网上的RyR对局部氧化还原电位敏感，温和的氧化应激即可使细胞内氧化还原电位轻微升高，明显增强RyR的活性，敏化Ca2+释放机制，由此提示，ROS对ER Ca2+的双向调节作用可能是浓度依赖性的。低浓度时(纳摩尔水平)，ROS促进环腺苷二磷酸核糖(cADPR)的合成，协同钙调蛋白一起开放了RyR，而高浓度时(毫摩尔水平)，ROS导致RyR之间和RyR与肌浆网(sarcoplasmic reticulum，SR)相关蛋白的巯基被氧化成二硫键，使这些蛋白聚集，形成大分子交联复合体，进而抑制通道的活性，损伤了Ca2+释放机制［19－20］。

3.3 ROS对ER Ca2+摄取的调节 虽然ER Ca2+信号是由Ca2+释放所引起的，而充当维持Ca2+库稳定角色的Ca2+的再摄取也是Ca2+信号的重要组成部分。正常情况下，Ca2+通过SERCA泵由胞质摄入ER腔内，由RyR和IP3R通道释放入胞质，而大部分被释放到胞质中的Ca2+会由钙泵重新摄取回ER中，以维持ER内Ca2+浓度。因此ER内Ca2+的积累主要是通过SERCA泵的活动来完成的。Zhu等［21］在小鼠缺血缺氧细胞模型中发现有ROS的产生及ER钙泵对氧化损伤敏感，在肝细胞缺血缺氧后，ROS能使ER腔内蛋白质被氧化修饰并滞留于ER腔内，从而使蛋白质合成受抑，ER腔内Ca2+耗竭，导致细胞凋亡。Ca2+-ATPase作为已知的ERS的启动因子，由于氧化损伤可抑制Ca2+-ATPase的活性，因此ROS可通过抑制Ca2+-ATPase而影响ER内Ca2+的贮存，从而影响细胞内Ca2+的稳态，引起ERS［10］。研究表明［6］用抗氧化剂MnTMPyP阻断了亚硒酸钠作用早期诱导的ERS介导的NB4细胞胞质内Ca2+的增加，说明ROS参与了亚硒酸钠引起的细胞内Ca2+稳态的变化。ROS的产生可以诱导ER内Ca2+释放引起ERS，而ER内Ca2+的释放又进一步刺激线粒体内Ca2+的聚集，引起线粒体损伤，进而诱导细胞凋亡。

3.3.1 CRT对Ca2+-ATP的调节 钙网膜蛋白(calreticulin，CRT)是ER腔的主要Ca2+结合伴侣蛋白，CRT通过C-结构域与Ca2+呈高容量性结合，增加ER腔的Ca2+储存能力。Nutt等［22］通过对爪蟾(Xenopus)卵母细胞研究发现，CRT与SERCA2b糖基化的C-末端尾直接作用，可调节ER内Ca2+储存，ER Ca2+充足时，两者结合，抑制ATP酶活性，胞质内Ca2+向ER转运停止。当ER Ca2+耗竭时，两者解离，ATP酶活化，回收胞质内Ca2+。由此提示CRT对ER膜的Ca2+-ATP酶起到一个Ca2+感受器的作用。

3.4 ERO1-α与IP3R介导的细胞凋亡 Sevier等［23］研究发现ERS状态下，未折叠蛋白在ER中积累，而细胞自身可以通过放缓翻译速度并增加正确折叠的蛋白质产物来进行矫正。但随着ERS持续加剧，ERS转录因子CHOP延长表达则会引起细胞凋亡，而这种细胞凋亡体系可能是由ER中释放的Ca2+引发的，但具体机制尚未明确。Li等［24进一步对ER中连接CHOP与Ca2+释放的两种蛋白质ERO1-α(ER oxidase 1-α)氧化酶和 Ca2+通道蛋白 IP3R进行研究。ERO1-α是CHOP转录后产物，能够氧化ER腔，通过促进IP3R中关键的二硫键的形成，从而使该通道更加活跃。正常情况下，在ERS的细胞中，IP3诱导的Ca2+释放(ⅡCR)是不断升高的，但应用siRNA敲除ERO1-α和IP3R从而使ERO1-α和CHOP功能缺失，可抑制ⅡCR的升高和ERS下的细胞凋亡。在CHOP敲除的巨噬细胞中使ERO1-α再表达，可引起ERS诱导的ⅡCR升高和细胞凋亡。应用Tunicamycin刺激正常小鼠后，其体内未被敲除CHOP的巨噬细胞中的ⅡCR是呈升高的趋势。由此可见，CHOP所诱导的细胞凋亡可能是通过触发Ca2+依赖的ERO1-α-IP3R信号通路而完成的。

4 展望

ERS与细胞凋亡及肿瘤的发生、发展都密切相关。ERS引起的细胞凋亡不同于线粒体介导的细胞凋亡，有一套自身的信号传递通路，称为ER相关性死亡(ER-associated death，ERAD)途径。而且参与ERS的分子伴侣和感受蛋白是ERS特异诱导的，因此它们能够作为治疗肿瘤的有效靶点。ROS作为ERS的上游信号，研究两者之间的内在联系及其作用机制，可使我们进一步了解肿瘤细胞凋亡机制与ROS之间的联系，为开发治疗肿瘤疾病的化疗药物提供新的思路。而ERS诱导的细胞凋亡是一类新的凋亡途径，ERS介导的细胞凋亡与其他途径的凋亡有着密切的联系，其反应机制涉及UPR、Ca2+的平衡以及氧化应激等机制，许多方面仍未确定，因此需要进一步研究，为肿瘤治疗提供新的途径。

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