猪瘟疫苗免疫综述

田召芳，李春蕾，张文娟，陈 蕾，王伟涛

（1.烟台市动物疫病预防与控制中心，山东烟台 264003；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

猪瘟是由猪瘟病毒引起的猪的传染病，遍及世界各地，其特点是传染性强，发病率极高，死亡率较高。发生过猪瘟疫情的规模场连续传播的可能性极大，偶有耐过猪只则成为僵猪，失去饲养价值，严重威胁着养猪业的发展。目前，对于猪瘟的治疗尚未找到有效的方法，用疫苗预防仍然是主要的防控手段。本文主要讨论猪瘟疫苗的研究进展、免疫失败的原因及免疫程序。

1 猪瘟疫苗的研究进展

1.1 传统疫苗的研究

猪瘟兔化弱毒苗是目前世界上应用最为广泛的疫苗，包括组织苗（淋脾苗）和细胞苗。

我国1954年成功培育出猪瘟兔化弱毒株并制成疫苗（CLS），也叫“C株”或“K株”。疫苗病毒的复制主要在淋巴样组织，特别是扁桃体，但有时能从肾脏检查出苗毒抗原。该苗毒株不通过怀孕猪的胎盘屏障感染胎儿。猪瘟兔化弱毒株毒力不返强，在猪体内连续传代后仍保持原弱毒的特性。对乳猪和种猪无残余毒性。接种各年龄的各品种猪，不产生猪瘟临床症状，仅出现轻微病毒血症，免疫后4~32 d内，免疫猪不从尿中排毒，免疫猪与非免疫猪同圈饲养60 d，不发生接触感染。检查免疫猪脏器带毒情况，证明免疫后7 d的猪体中脾及血尚存微量毒，17 d以后，免疫猪的血液、脾及骨髓中已均无病毒存在。免疫10~14日龄哺乳仔猪，不影响发育，注射怀孕1~3月龄母猪，不引起流产、死胎。

我国在1957年开始推广猪瘟兔化弱毒组织苗，最初提倡就地制苗，就地使用。继而真空冷冻干燥苗技术研制成功，冻干苗便于保存，成为我国防制猪瘟的有力工具。并开始采用家兔淋脾组织制苗。后又将猪瘟兔化弱毒接种牛，病毒可在牛体内繁殖，淋脾毒价可达到乳兔水平，便于就地制苗或生产厂制冻干苗。1974年黑龙江兽医研究所用原代猪肾细胞培养兔化弱毒制苗，获得成功。1975年开始由中国兽医药品监察所组织全国兽医药品厂进行病毒型疫苗转入细胞培养制苗的技术革新，将兔化弱毒接种原代肾细胞进行工厂化制苗。为了避免用同源细胞生产疫苗有污染强毒的危险，1980年研制成功绵羊肾细胞苗，1982年奶山羊肾细胞苗和1985年犊牛睾丸细胞苗研制成功，为猪瘟疫苗生产开辟了一条新的道路。羊肾和犊牛睾丸细胞苗接种猪后3 d可产生免疫力，5 d可产生坚强的免疫力，免疫期一年。

除我国猪瘟兔化弱毒苗（C株）以外，日本的细胞弱毒苗（GPE-株）和法国的细胞弱毒苗（Thiverval株）也在一些国家使用。

1.2 猪瘟ST传代细胞系疫苗

中国兽医药品监察所等选择了一种对猪等动物安全、适宜于猪瘟病毒增殖的传代细胞系，将ST细胞系感染裸鼠，观察近100 d，没有发现致瘤现象，也没有观察到组织病理变化，将该细胞连传20多代，没有染色体变化。证明细胞是安全的。猪瘟兔化弱毒病毒在该细胞中能实现高滴度增殖，通常情况下，每毫升细胞疫苗毒液的毒价能稳定在50到100万个兔体感染量，如果采用生物反应器，则可达到300万倍左右，是原代牛睾丸细胞猪瘟疫苗毒价的10~50倍。由于猪瘟兔化弱毒良好的安全性，高病毒含量的传代疫苗对猪安全。免疫效力检验结果显示，将该疫苗做5 000倍稀释免疫猪，仍能100%抵抗强毒的攻击。高出牛睾丸原代细胞生产的疫苗近20倍。实验室免疫接种一次免疫期可以达到一年以上。部分省市推广应用效果良好。

1.3 基因工程亚单位疫苗

Hulst等[1]将Brescia株E2基因置于PRV的gX基因信号肽之后，构入杆状病毒AcNPV多角体启动子p10调控序列之下，构建了能表达E2蛋白的重组杆状病毒BacE1±（即pAcAS3gXE1±TMR），并在昆虫细胞sf21中成功表达。将BacE1-感染sf21细胞后表达纯化的20μg E2蛋白免疫猪，能很快产生很高的抗体效价，且能完全抵抗100LD50的CSFV Brescia强毒株的攻击，其诱导出的中和抗体效价（Neutralizing peroxidase-linked antibody，NPLA）大于3 000，远高于CSFV弱毒疫苗C株诱导的NPLA（NPLA≥50即可使猪得免疫保护）。

Van Rijn等利用杆状病毒表达系统表达了两种分别缺失了B/C抗原单位和A抗原单位的突变E2蛋白，其免疫猪后进行攻毒试验，结果表明，E2蛋白上的一个结构抗原单位诱导的免疫反应就能够保护猪抵抗CSFV的攻击。Van Rijn PA等将E2基因N端含A和BC抗原表位而不含TMR的部分构入杆状病毒，用其表达产物进行免疫实验，证明无TMR的E2表达产物能保护同源病毒的攻击，单一A或BC区也能保护。杆状病毒表达体系表达E2，可望成为一个新的最为安全有效的亚单位疫苗。

1.4 病毒活载体疫苗

以无致病力或低毒力的痘苗病毒（VAC）和伪狂犬病毒（PRV）或腺病毒为载体，将猪瘟病毒E2基因与之重组研制出的基因重组疫苗，免疫动物后可对二种病毒产生良好的保护力。

Hahn J等[2]将E2基因和伪狂犬病毒gX信号肽序列置于猪痘病毒P11启动子之下，构建了表达E2的重组猪痘病毒（recombinant swinepox virus），该重组病毒表达的E2蛋白以二聚体的形式分泌到感染细胞的胞浆中。

Hooft等将CSFV E2基因插入PRV的糖蛋白gE基因位点，并分别置于不同启动子控制之下，比较了这些启动子对表达水平的影响，发现用人巨细胞病毒的立即早期基因启动子的效果最好，用它构建的E2重组疫苗对猪的免疫效果最好。为了使研制的猪瘟病毒活载体更安全，最近Peeter等利用伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD具有病毒侵入宿主细胞所必需但并不为病毒在细胞内的扩散所必需的特性。构建了能表达猪瘟病毒E2蛋白的gD/gE双缺失的伪狂犬病毒重组疫苗，免疫接种试验表明该活载体疫苗能使猪获得对伪狂犬和猪瘟的双重保护。因此目前国内外在运用PRV作为活病毒载体疫苗的研究比较活跃。

另外，还有人进行了用腺病毒表达E2蛋白的尝试。Hammond JM等[3]将CSFV Weybrdge株的E2基因插入进PAV血清型3的基因组中，置于主要晚期启动子的调控之下，构建了含E2基因的重组腺病毒rPAV-gp55，并用其进行动物实验，一次接种就能使猪得到良好的保护，皮下免疫可获得100%的保护。且免疫攻毒猪无临床症状，剖检无病变。

1.5 DNA疫苗

DNA疫苗可以诱导体液免疫，又可诱导细胞免疫，通过初步田间试验，已经显示了较好的免疫力。

Hammond JM等[4]在构建含E2基因的重组腺病毒（rPAV-gp55）后，又构建了一株含E2基因的裸质粒DNA（naked plasmid DNA）疫苗，并用其作基础免疫后再用rPAV-gp55作二次免疫，然后再用强毒攻击，保护效果比单用rPAV-gp55免疫好，单用rPAV-gp55后攻毒有轻微体温反应，而联用无体温反应，脾、淋巴结剖检无病变。余兴龙、涂长春等用pIRESlneo构建了一株含E2基因的真核表达质粒pcDSW并用其制备了抗CSFV的单抗，并用猪瘟DNA疫苗成功保护了猪瘟强毒对猪的攻击。但是，Markowska等用DNA疫苗免疫保护实验表明，强毒攻击后体温反应有2天高于40℃，T、B淋巴细胞活性有轻微上升。尽管如此，以E2作为免疫基因构建的CSFV DNA疫苗已显示出了诱人的前景。

1.6 标记疫苗的应用研究

Moormann等[5]将CSFV C株gp55的N端序列用Brescia株相应部分替代，构建了一株杂交病毒株Flc-h6，用现有的抗E0和E2的单抗，可把Flc-h6与强毒Brescia及疫苗C株分开。用Flc-h6作为疫苗免疫猪，可以方便地将疫苗株与野毒感染猪分开。Dewulf J等做了亚单位标记疫苗的保护试验，对照组有40%出现死亡并出现临床症状，而免疫组能抵抗强毒攻击。另外的研究又表明，E2亚单位标记疫苗不能使猪获得完全保护，不能完全抵抗病毒感染和排毒的研究结果。

更加完善的研究也正在进行，Widjojoatmodio MN等构建了Flc23（缺失E0中215位AA）和Flc22（缺失E0中66位AA）两株重组病毒，能在SK6c26细胞上增殖，但不能产生感染性病毒，用其免疫猪后能产生抗E0的中和性抗体，抵抗Brescia强毒株的攻击。后该组人员又用缺失E2基因中B/C区域（Flc4）或A区域（Flc48）的非传播性标记疫苗（non-transmissible marker vaccines）鼻内接种进行免疫，攻毒后可获得全部或部分保护。

2 猪瘟免疫失败的原因

2.1 母猪持续感染与垂直传播

持续感染母猪经胎盘垂直传播HCV是给仔猪造成免疫失败的一个重要因素[6]。这种持续感染的HCV可在母猪体内维持750 d以上甚至终身存在，带毒母猪产下的似乎健康的先天性感染仔猪可在长达数月之久排出大量猪瘟病毒而不表现出症状，也检测不出猪瘟抗体。带毒母猪综合征在妊娠母猪的感染率可达43%。妊娠母猪感染猪瘟病毒后，在整个妊娠期都可通过胎盘传播。病毒是由血液通过胎盘屏障传给胎儿的，传播率达45%~86%。吃初乳和接种猪瘟疫苗不能阻止带毒仔猪的死亡。免疫HCV不能使带毒仔猪产生免疫保护力，即仔猪先天性免疫耐受，强毒攻击可引起死亡。HCV垂直传播的带毒猪可发生水平传播。HCV持续感染可引起母猪生殖系统病理变化导致繁殖障碍随胎次增加而加强。

2.2 带毒公猪的垂直传播

用RT-PCR检查带毒公猪自然交配所产死胎的病毒基因型，结果表明[7]：死胎感染的病毒基因型与带毒母猪原有的病毒基因型不同，而与带毒公猪的病毒基因型相同。证明带毒种猪不仅能通过母猪胎盘垂直传播，而且能通过公猪精液垂直传播，这是造成猪瘟持续感染的又一重要原因。

2.3 母源抗体的影响

当母源抗体水平在1:16时，使用2个免疫剂量疫苗接种3头猪，在强毒攻击后，虽然这些猪均存活下来了，但3头猪均有持续24~72 h的潜伏期，体温升高1.5~2℃，持续2.5~8 d，而使用4个剂量免疫接种的3头猪，仅1头体温升高2℃，持续时间仅为2.5 d。其他两头猪既无潜伏期，又无体温升高。试验表明，提高疫苗中的病毒含量对母源抗体不整齐的猪场的猪瘟控制是非常必要的。

目前欧洲为了消灭猪瘟的亚临床感染，多采用加大免疫剂量的方法。欧洲药典规定用C株疫苗免疫时，肌肉注射剂量为100PD50（400RID）。我国猪瘟细胞苗出厂检验以5万倍稀释能致兔体热反应为合格，即每mL原液含5万个RID，规定的免疫剂量为150 RID（含37PD50），远远低于国际标准，况且我国猪场中存在的猪瘟持续感染问题和其他病原混合感染的问题比发达国家严重的多，使用常规免疫剂量预防接种，在母源抗体参差不齐和有猪瘟病毒持续感染的猪场，往往会造成免疫失败。

2.4 非猪瘟病毒感染对猪瘟疫苗免疫效果的影响

利用20头9月龄左右猪瘟、伪狂犬、猪繁殖与呼吸障碍综合症抗原、抗体阴性猪，将其分成6组，分别利用猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病毒（PRV）和猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒（PRRSV）单独或混合感染，7 d后，连同对照猪4头，免疫接种猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV），13 d后连同4头阴性对照猪一起攻击猪瘟石门强毒。整个试验期间分别每天测温，观察临床症状，每周采集扁桃体和血样做各种病毒抗原及抗体检测。结果在攻击石门强毒后2周，单独和混合感染了非猪瘟病毒后接种HCLV疫苗的4个免疫组12头猪除1头外，11头全为HCV抗原检测阳性，且多呈强阳性；而单一HCLV疫苗免疫组在猪瘟强毒攻击后检测不到HCV；所有HCLV疫苗免疫猪均存活，而非免疫对照组4头猪全部在攻毒16日内死亡。试验表明非猪瘟病毒感染的确对猪瘟疫苗免疫效果有影响，能造成猪瘟疫苗免疫的失败[8]。

2.5 疫苗质量对免疫效果的影响

我国的猪瘟疫苗存在两大问题，一是疫苗中病毒含量低。在脾淋组织疫苗方面，我国现有猪瘟兔脾淋组织疫苗工艺落后，制造疫苗所需的大耳白兔子数量太少，而且由于品种退化的原因，远远满足不了需要，同时效力检验的标准太低；在牛睾丸原代细胞疫苗方面存在的问题更大，我们现有的标准只有欧洲等发达国家的1/4，病毒含量太低，在其他疾病混合感染，母源抗体存在的情况下，很难达到应有的免疫效果。除此之外，由于牛感染BVDV非常普遍，有牛睾丸原代细胞生成疫苗，不可避免的会遭到BVDV污染，污染了这种病毒，一是直接影响病毒在细胞中的增殖，同时还会造成BVDV疾病的传播，直接影响胎儿存活。运输的冷链系统不完善导致猪瘟病毒存活力降低也是引起猪瘟免疫失败的重要原因。

3 免疫接种程序

目前国内还没有统一的猪瘟免疫程序，各地养猪场的免疫程序大同小异，其基本情况大致有三种。

3.1 种猪集中统一免疫

种公猪、种母猪每年集中统一免疫两次。仔猪21~25日龄左右首次免疫，50~60日龄左右加强免疫。

此程序必须经常对仔猪的母源抗体进行监测，随时调整仔猪的首免时间。可通过1~2年的监测，找到本场仔猪的母源抗体消长规律，从而确定时间。

3.2 断奶时母猪与仔猪同时免疫

种公猪每年集中统一免疫两次，种母猪断奶后与其仔猪同时免疫，仔猪50~60日龄左右加强免疫一次。

采用这个程序时，最好也是先测定仔猪断奶时的母源抗体效价，再确定免疫时间与母猪、仔猪的免疫剂量。仔猪母源抗体在1:32以上时，以4头份疫苗剂量的免疫效果最佳。

3.3 超前免疫

种公猪、种母猪每年集中统一免疫两次。仔猪吸吮初乳前进行免疫，注射后1~2 h让其自由吮奶[9]，30~40日龄时加强免疫一次。

由于超前免疫存在劳动量大，难以实施等缺点，非疫区可不进行超前免疫，但应加强分娩猪舍的消毒，加强母猪的抗体检测，确保母猪健康。空怀母猪的抗体水平不低于1:64，分娩母猪的抗体水平不低于1:32。对反复接种抗体水平仍然很低的母猪及带毒母猪应彻底淘汰。

[1]Hulst M M，Westra D F，Wensvoort G，et a1.Glycoproteis E1 of hog cholera virus expressed in insect cells protects swine from hog cholera[J].Journal of Virology，1993，67（9）：5435-5442.

[2]Hahn J，Park S H，Song J Y，et a1.Construction of recombinant swinepox viruses and expression of the classical swine fever virus E2 protein[J].J Virol Methods，2001，93（1/2）：49-56.

[3]Hammond J M，Jansen E S，Morrissy C J，et a1.Oral and sub-CU-taneous Vaccination of commercial pigs with a recombinant porcine adenovirus expressing the classical swine fever virus gp55 gene[J].Arch Virol，2001，146（9）：1787-1793.

[4]Hammond J M，McCoy R J，Jansen E S，et a1.Vaccination with a single dose of a recombinant porcine adenovirus expressing the classical swine fever virus gp55（E2）gene protects pigs agains Classical swine fever[J].Vaccine，2000，18（11/12）：1040-1050.

[5]Moormann R J，Bouma A，Kramps J A，et a1.Development of a classicsl swine fever subunit marker vaccine and companion diagnostic test[J].Vet Microbiol，2000，73（2/3）：209-219.

[6]吕宗吉，涂长春，余兴龙，等.我国猪瘟的流行病学现状分析[J].中国预防兽医学报，2001，23（4）：300-302.

[7]王琴，宁宜宝.猪瘟免疫失败主要原因的解析[J].中国兽医杂志，2005（6）：61-63.

[8]刘忠琛，黑立新，阿尔孜.猪瘟免疫失败的原因及解决办法[J].河南畜牧兽医，2004，25（6）：16-17.

[9]丘惠探，麦志均，粱健尧，等.猪瘟不同顺序零天免疫的免疫效果比较[J].中国预防兽医学报，2001，23（2）：125-127.