奶牛魏氏梭菌病病原的分离鉴定

罗毅

（沈阳市动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳 110034）

魏氏梭菌是革兰氏阳性大杆菌，属条件性致病菌，广泛分布于自然界，是肠道中的常在菌群之一。该菌能产生多种外毒素和酶类，其中，外毒素是主要的致病因子[1]。动物一旦感染，死亡率可达70%~100%。韩彗民等[2]认为能够造成家畜机体抵抗力下降的因素均能导致魏氏梭菌大量增殖、产生毒素进而侵入血循环系统并导致发病。柴同杰等[3-4]提出同样的观点，即动物魏氏梭菌感染导致的猝死症，主要由肠毒血症造成机体主要器官的衰竭所致。

2010年11月沈阳市一奶牛小区奶牛发生猝死，死亡奶牛无任何前驱症状，突然发病死亡，以全身实质脏器及消化道出血为特征，一周内全群发病死亡。为查找病原，我们采集了有关病料进行了病原分离、鉴定，并进行了动物回归试验。现将有关结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料 来源于沈阳市苏家屯区一奶牛养殖小区死亡的奶牛，病料主要包括死亡牛的心、肝、脾、肺、肾、小肠等病变组织及肠内容物。

1.1.2 主要试剂 普通琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司；厌氧肉肝汤培养基、绵羊鲜血琼脂平基均由本实验室自行配制；VITEK-ANI厌氧菌鉴定卡购自梅里埃公司；革兰氏染色液购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.3 试验动物 实验用小白鼠购自沈阳医学院。

1.1.4 主要仪器 VITEK全自动微生物分析系统（VITEK-32，法国梅里埃公司）、生物安全柜（NUAIRE NU-430-600E，美国NUAIRE公司）、高压蒸汽灭菌器（TOMY SX-700，日本）、生化培养箱（SPX-100B-Z，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、生物显微镜（OLYMPUS-CX31，日本）、电子天平（METTLER-AE240，梅特勒-托利多上海仪器有限公司）、水浴箱（SALVIS-IC240，瑞士）、离心机（SIGMA-3K30，美国）。

1.2 方法

1.2.1 病原分离鉴定

1.2.1.1 形态观察 无菌操作采取肠内容物、黏膜刮下物、肝、脾做涂片革兰氏染色，然后进行显微镜检查。

1.2.1.2 分离培养 将肠内容物80℃，水浴15 min，然后2 000 rpm离心15 min，取上清液，一份接种麦康凯琼脂平皿培养，另一份接入厌氧肉肝汤，在37℃温箱中培养20~24 h，然后在普通琼脂平板和绵羊鲜血琼脂平板上划线，37℃温箱进行分离培养。同时将各脏器接种于肉肝汤，厌氧培养，再取培养物接种绵羊鲜血琼脂平皿培养，挑单个菌落进行纯培养同时染色镜检。

1.2.1.3 生化试验 将分离菌纯培养物重新接种普通琼脂培养基，37℃培养20~24 h上卡，用VITEK-32进行检测。

1.2.2 动物试验

1.2.2.1 肠毒素检查 无菌操作取死牛病变明显的肠内容物，用灭菌生理盐水进行l:l稀释后，4℃，3 000 rpm离心10 min，取上清液，再以4℃8 000 rpm离心15 min。然后取上清液腹腔注射16~20 g小白鼠5只，同时设立对照（注射灭菌生理盐水）2只，l mL/只，72 h内观察结果。

1.2.2.2 分离菌毒力测定 分离菌接种厌气肉肝汤中，取20 h的培养物腹腔注射小白鼠0.5 mL/只，注射5只，观察结果。

2 结果

2.1 病原形态观察

病死动物的肝脏和肠管内容物革兰氏染色镜检均见到一种革兰氏染色呈阳性，有荚膜的粗大杆菌，单个或成双排列。有的有芽孢，位于菌体偏端。纯培养的细菌形态为革兰氏阳性粗大杆菌，个别有芽孢。

2.2 培养特性

加温处理后的肠内容物在麦康凯琼脂平皿上无细菌生长，而接入厌氧肉肝汤试管1培养18 h后观察，可见肉汤形成均匀的混悬液，液面上方靠近液体侧试管壁上有2 cm长的石蜡附着。琼脂平板培养菌落呈灰白色，表面光滑、湿润、圆盘型，有的有放射状条文的大菌落，血琼脂板上有溶血环。

2.3 生化实验

经VITEK-32进行检测，结果99%为产气荚膜杆菌。

2.4 动物实验

2.4.1 肠毒素检查结果 肠内容物处理后注射5只小白鼠，24 h内全部死亡，而对照组小白鼠全部存活，证明肠道内容物中有毒素存在。

2.4.2 分离菌培养液的毒力测定 肝片肉汤培养物注射小白鼠，于72 h内全部死亡。死后剖检见小鼠喉头、气管环充血、出血；肺充血、气肿；心尖端心肌表面有树枝状充血；肝脏出血；小肠肠壁松弛、肠粘膜变得薄而透明、浆膜有出血斑、盲肠粘膜有出血斑点、内有稀粪并有气泡；肝脏肿大、质地脆易碎、呈土黄色；脾脏色深褐；肾脏淤血。

3 讨论

近年来，我国魏氏梭菌感染动物致病的报道较多[5-9]，因其死亡率高给养殖户带来较大经济损失。由于魏氏梭菌病一般均是由细菌在肠道内产生毒素引起发病，细菌本身并不一定侵入机体，因此脏器内一般难于分离到此菌，而肠道内菌群又较多，魏氏梭菌又是肠道内的常在菌，故而分离较难，且即使是从肠道分离出此菌也很难区分是否是致病菌，必须结合临床症状和动物实验综合来诊断。

魏氏梭菌正常存在于人和动物肠逍内，并不致病，饲养条件突然改变，气候骤变或拥挤状态等原因导致肠道细菌菌群紊乱，微生态平衡破坏，魏氏梭菌趁机剧烈地繁殖，瞬间在肠道产生了大量的外毒素，毒素粘附在肠粘膜上皮上，妨碍了氨基酸的吸收和运输，这时肠壁的通透性升高，使得毒素进入血液循环，引起肠毒血症，从而导致机体重要器官衰竭[3]。引起动物死亡，此病的发生来势凶猛，传播快，发病急剧，死亡迅速，往往来不及治疗全群死亡，因此预防是防止该病发生的最好办法。平时应加强动物的饲养管理，减少动物的应激反应。

[1]Laetitia P，Maryse G，Michel R P.Clostridium perfringens：toxinotype and genotype[J].Trends in Microbiology，1999，7（3）：104-110.

[2]韩慧民，姚湘燕，孟锐奇.家畜猝死症病因学研究[J].吉林畜牧兽医，1996，18（4）：22-24.

[3]柴同杰，马瑞华，常维山，等.产气荚膜梭状芽抱杆菌的流行与致病机制[J].中国预防兽医学报，2001（1）：70-72.

[4]Chai Tongjie.Vorkommen von Iuftgetragenen Keimen in Tierstaellen and der Stallum gebung[M].Germany：Verlag Shaker，1999：55-56.

[5]周浮伍，李华章．A型魏氏梭菌所致家畜“猝死症”的诊断与防制[J].畜牧与兽医，1997，29（3）：262.

[6]王明俊.兽医生物制品学[M].北京：中国农业出版杜，1996：504．

[7]张玉果.羊A型魏氏梭菌病 [J].中国兽医杂志，1998，24（1）：26．

[8]记春华，王世洲，武兴周，等．初生仔猪A型魏氏梭菌病诊断与防冶[J].中国兽医杂志，1992，18（4）：46.

[9]王海荣，唐德宏，鹿道新，等.畜舍环境中魏氏梭菌分离及基因型鉴定[J].中国人兽共患病杂志，2005，21（11）：985-987.