细胞凋亡与骨肉瘤

李梅，张余

综述

细胞凋亡与骨肉瘤

李梅，张余

骨肉瘤；细胞凋亡

细胞凋亡又称程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD），是由基因控制的、不同于细胞坏死的细胞自主有序的死亡。正常生理状态下，机体可通过细胞凋亡清除衰老或异常的细胞，并维持内环境稳态。而在病理状态下，细胞凋亡调控失调会破坏细胞增殖与凋亡之间的平衡，对机体产生破坏性影响，如凋亡过度会引起老年性痴呆、肌肉萎缩、发育异常等疾病，而凋亡不足则可导致肝癌、乳腺癌、胶质瘤和免疫系统疾病等。骨肉瘤是好发于青少年的原发恶性肿瘤，不仅恶性程度高，侵袭程度强，而且容易复发、转移，预后差，治疗效果不理想，研究细胞凋亡对骨肉瘤发生、发展的影响，探讨细胞凋亡与骨肉瘤形成机制的相关关系，有助于寻找有针对性的治疗措施、提高骨肉瘤治疗水平。现就骨肉瘤的凋亡相关因子及其调控机理综述如下。

1 与骨肉瘤相关的细胞凋亡途径

目前认为与骨肉瘤相关的细胞凋亡途径主要有两条。

1.1 死亡受体配体途径

即死亡配体与细胞表面的死亡受体相结合，吸引胞内的信号转导蛋白（TRADD、FADD、RIP、CRADD等），并募集启动型caspases（caspase-2、caspase-8等）的前体，生成死亡诱导信号复合物并激活caspases，再由效应型caspases对其特异性底物进行降解，最终导致骨肉瘤细胞凋亡。其中，死亡受体主要是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）受体家族，目前主要有TNFR1、TNFR2、Fas、DR4、DR5等十几个成员，配体主要是FasL、TNF等。体外实验证实死亡受体DR4、DR5可通过诱导凋亡的方式来发挥对骨肉瘤细胞株HOS-8603的抑制作用，且抑制作用存在剂量及时间依赖性；研究还表明受体诱导凋亡是caspase依赖性的，caspase-3发挥着核心作用；此外，Fas/ FasL信号途径障碍可导致骨肉瘤的发生发展，且Fas的表达与肺转移呈负相关，有可能作为骨肉瘤肺转移治疗的靶标之一[1]。

1.2 线粒体途径

部分凋亡刺激因子通过线粒体激活细胞凋亡途径，即刺激线粒体释放细胞色素C，释放到胞浆中的细胞色素C与凋亡蛋白酶活化因子-1 (apoptosis protease activating factor-1，Apaf-1)结合形成多聚体；并募集caspase-9前体与其形成凋亡小体，caspase-9被激活并活化下游的caspase，诱导细胞凋亡[2]。Lin等[3]研究发现，在一类黄酮类药物诱导骨肉瘤细胞U-2OS凋亡的过程中，线粒体膜电位明显降低，细胞色素C表达量升高，表明线粒体途径在骨肉瘤细胞凋亡中发挥重要作用。

2 与骨肉瘤相关的细胞凋亡因子

诸多文献报道Bcl-2、凋亡蛋白抑制因子（inhitors of apoptosis proteins，IAPs）、p53、caspases等细胞凋亡因子在骨肉瘤中的表达以及对骨肉瘤患者预后的影响，认为这些细胞凋亡因子在骨肉瘤的发生发展中起到重要的作用，可作为骨肉瘤治疗及预后的指标。

2.1 Bcl-2家族蛋白

在与凋亡相关的调控基因中，Bcl-2是研究最深入、与凋亡关系最密切的基因之一，主要包括凋亡抑制蛋白Bcl-2类（Bcl-2、Bcl-x1、Bcl2w、Mcl-1、Ced-9等）和促凋亡蛋白Bax类（包括Bax、Bid和仅有BH3结构域的Bid、Bim、PUMA等蛋白）两种[4]。

骨肉瘤中对有凋亡抑制作用基因的研究主要以Bcl-2为主，它可编码α和β 2种蛋白，存在于线粒体外膜及部分内质网中。目前普遍认为骨肉瘤中Bcl-2发挥凋亡抑制作用的机制是通过阻断线粒体途径[5]，即阻断线粒体内细胞色素C的释放进而抑制下游效应因子的激活，从而发挥凋亡抑制作用；Bcl-2蛋白也可通过与促凋亡蛋白Bax相结合而抑制凋亡。不同肿瘤中Bcl-2的表达及与预后的关系也不尽相同[6]。学者们通过免疫组化法研究人骨肉瘤中的Bcl-2基因，结果显示骨肉瘤组织Bcl-2蛋白染色阳性率和染色程度均较正常骨组织增高，揭示骨肉瘤的发生与凋亡异常有关[7]。体外实验亦证实，骨肉瘤细胞中Bcl-2呈高水平表达，且Bcl-2对骨肉瘤细胞系凋亡有抑制作用[8]。Ferrari等[9]的研究表明，在多数伴有肺转移的骨肉瘤复发病例中，Bcl-2的表达较原发肿瘤强，但Bcl-2蛋白的表达并不随骨肉瘤分期的升高而升高，可见其表达情况并不能作为骨肉瘤恶性程度的指征。

促凋亡蛋白Bax主要存在于胞浆，当细胞受到凋亡信号刺激时转入线粒体中，并通过线粒体途径发挥促凋亡作用。Eliseev等[10]证实，骨细胞的特异性转录因子RUNX2以Bax为靶点，通过提高其表达量来增加骨肉瘤细胞Saos-2对凋亡的敏感性。多项研究表明，Bcl-2与Bax比值的高低决定细胞凋亡与否，目前认为其机理是Bax-Bax二聚体可诱导凋亡，但当Bcl-2蛋白量升高时可与Bax形成更稳定的Bcl-Bax二聚体，因此拮抗了Bax的促凋亡作用[11]。Kaseta等[4]的研究还认为，Bcl-2与Bax的比值与骨肉瘤细胞凋亡的抑制呈正相关关系。李征等[12]对42例骨肉瘤的免疫组化研究显示，随骨肉瘤病理分级的升高，Bax蛋白表达阳性率呈下降趋势，但各分级之间无显著性差异，意即Bax并不能很好地反映骨肉瘤的恶性程度。

2.2 IAPs家族

IAPs家族都有1个或多个杆状病毒IAP重复序列（baculovirus IAP repeat，BIR），并通过此结构域发挥凋亡抑制作用。人类IAPs家族成员主要包括有6个，分别是XIAP、cIAP1、cIAP2、NIAP、Survivin、BRUGUE。研究显示，IAPs家族与骨肉瘤凋亡密切相关，其抗凋亡机制主要是阻断caspases蛋白酶激活级联反应途径，方式有：与caspases前体结合，干扰其激活；与Apaf-1竞争性结合，阻断caspases活化；直接与活化的caspases结合，抑制其裂解底物，与Bcl-2蛋白共同发挥凋亡抑制作用。研究发现，IAPs的表达水平与肿瘤性质、分化程度、预后及化疗效果有关，许多人类肿瘤中XIAP和Survivin等IAPs存在高表达。目前骨肉瘤中对IAPs家族成员的研究主要集中在cIAP1、cIAP2、Livin、Survivin[13]等。高大新等[14]的研究表明，survivin在骨肉瘤中呈现高表达，其表达水平与骨肉瘤WHO分型和转移有关，揭示Survivin可能通过抑制细胞凋亡的方式参与骨肉瘤发生发展过程，推测其可能成为评估骨肉瘤预后的重要依据。Trieb等[15]的研究也证实，Survivin是判断骨肉瘤患者预后的1个重要指标。

2.3 p53

p53是另一个参与骨肉瘤凋亡的重要基因，分为野生型和突变型2种。野生型p53是1种抑癌基因，主要功能是使细胞周期停滞在G1期，并修复损伤的DNA以维持基因组的稳定，这在人类骨肉瘤细胞实验中已有证实[16]。同时p53具有促凋亡作用，主要是通过上调Bax表达和下调Bcl-2表达来共同完成对细胞凋亡的促进作用；此外还可通过死亡信号受体蛋白途径诱导凋亡。有研究发现，发生p53基因突变的转基因鼠中以淋巴瘤、肺腺癌、骨肉瘤的发生率最高，p53基因的突变和失活正影响着骨肉瘤的发生、发展过程[17]。张世权等[18]通过免疫组化法检测p53蛋白在36例骨肉瘤和17例骨软骨瘤组织中的表达，p53蛋白阳性表达率为52.8%，显著高于骨软骨瘤组，揭示p53基因突变对骨肉瘤的发病机制有一定影响。而就p53是否能够引起肿瘤转移并影响患者预后而言，Ferrari等[9]认为，p53与高度恶性骨肿瘤的肺转移密切相关，可作为肺转移后肿瘤预后的检测指标，p53蛋白蓄积预示着肿瘤侵袭力强、预后差。

2.4 caspases家族

caspases即天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，是细胞凋亡蛋白酶，在哺乳动物至少有14种，分别是caspases1～14，它们结构相似，且具有共同特征，如均以无活性的前体形式存在，且具有自催化或相互激活的能力。在骨肉瘤中，caspases蛋白表达是不同途径细胞凋亡的最后共同通路，处于细胞凋亡的核心位置，因此当caspases失活或活性发生变化时可引起细胞凋亡障碍，对肿瘤的发生、发展产生影响。根据其在细胞凋亡中的作用，caspases可分为两大类：上游启动型caspases（caspase-2、caspase-8、caspase-9、caspase-10等）和下 游 效 应 型 caspase（caspase-3、caspase-6、caspase-7等）。上游启动型caspases主要通过与死亡受体信号通路中的分子结合并活化，来激活下游效应型caspases，启动细胞凋亡。caspases-3是caspases家族中重要的效应因子，有学者检测caspase-3在38例骨肉瘤及20例骨软骨瘤中的免疫组化表达，caspase-3在骨肉瘤和骨软骨瘤中的表达阳性率分别为52.6%和85%，两组差异具有统计学意义，进而推测组织中caspase-3表达的降低可能与骨肉瘤的发生密切相关[19]。体外实验结果亦表明，与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）共表达的caspase-3转染人成骨肉瘤细胞SOSP-9901后，肿瘤细胞出现明显的细胞凋亡特征，说明重构型caspase-3对成骨肉瘤细胞生长有抑制作用，并可诱导凋亡[20]。caspase-6则是另一个重要的效应分子，Wang等[21]的实验研究证实，人重组caspase-6融合蛋白对骨肉瘤SOSP-9607细胞具有靶向促凋亡作用。

3 针对细胞凋亡的骨肉瘤治疗

与其他肿瘤治疗类似，目前临床上常用的骨肉瘤治疗方式主要是放疗、化疗、热疗、基因治疗等，其作用机制之一便是诱发骨肉瘤细胞的凋亡。

3.1 放疗

主要通过射线辐射引发骨肉瘤细胞DNA损伤，当损伤无法修复时，p53基因发挥作用，启动凋亡并将骨肉瘤细胞清除。清除过程中涉及到凋亡途径中死亡受体配体Fas/FasL的介导，以及Bcl-2家族基因的参与。

3.2 化疗

许多抗肿瘤药物可通过启动凋亡机制杀伤肿瘤细胞，主要包括DNA损伤剂、抗代谢剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白抑制剂、蛋白激酶抑制剂和分化诱导剂等。其诱导细胞凋亡的机制主要有：（1）药物导致骨肉瘤细胞DNA损伤时，启动p53诱导细胞凋亡；（2）通过调节bcl-2/bax的比例或抑制bcl-2活性来诱导细胞凋亡；（3）调节线粒体膜状态，促进细胞色素C的释放，诱导细胞凋亡。

3.3 热疗

热疗诱导骨肉瘤凋亡的机制与放化疗相似，由凋亡相关基因p53、Bcl-2、Bax等共同参与。阿霉素联合微波热疗治疗成骨肉瘤的分子机制之一便是诱导骨肉瘤细胞凋亡，骨肉瘤细胞中p53的表达量也明显升高，提示p53参与骨肉瘤的细胞凋亡过程。此外，高温诱导的骨肉瘤凋亡也有热休克蛋白、Ca2+等的参与[22]。

3.4 基因治疗

与细胞凋亡相关的基因治疗是选择性地将促凋亡基因导入肿瘤细胞以增强肿瘤细胞对凋亡诱导的敏感性，或将抗凋亡基因导入正常细胞以增强其对放化疗及热疗凋亡诱导的抗性。例如，在体外将野生型p53导入肿瘤细胞可以诱导凋亡，将抗凋亡基因Bcl-2导入正常细胞可以增强其对化疗药物诱导凋亡的抗性；还可将反义DNA或反义RNA导入肿瘤细胞，抑制抗凋亡基因的表达以增加肿瘤细胞对化疗药物诱导凋亡的敏感性。已有研究表明survivin反义寡核苷酸对顺铂治疗骨肉瘤有明显的增效作用，同时可弥补骨肉瘤的耐药缺陷；反义c-myc寡核苷酸可诱导人骨肉瘤细胞凋亡，对瘤细胞的增殖有抑制作用[23]。此外还有针对Bcl-2及IAPs的反义治疗，Tong等[24]认为，下调IAPs水平可增强细胞对死亡受体刺激的敏感性，诱导细胞凋亡。Kim等[25]则将Bcl-2反义寡核苷酸用于Bcl-2高表达的肿瘤中促进细胞凋亡，对淋巴瘤、骨髓瘤等多种肿瘤均有效。

3.5 其它应用

在与细胞凋亡相关的骨肉瘤治疗中，还有针对凋亡相关受体配体、caspases家族及核因子（nuclear factor）-κB等的治疗措施。其中NF-κB的激活是骨肉瘤化疗耐药的重要原因之一，还可直到抑制凋亡的作用，因此可能成为骨肉瘤治疗的新靶标[26]。

近年来，国际上对骨肉瘤开展以新辅助化疗为主的综合治疗，尽管患者生存率明显提高，但仍有近一半的患者由于对药物不敏感，而在术后2至3年死于肺转移[27]。治疗前缺乏准确判断肿瘤恶性程度和预后的标记物，是治疗失败的原因之一。而寻找与骨肉瘤发生发展相关的特异性标记物，可以有效判断骨肉瘤的恶性程度和预后，进而指导化疗药物和手术方案的确定。学者们提出可对化疗前骨肉瘤患者的活检组织进行p53、c-myc、bcl-2以及细胞凋亡指数（apoptosis index，AI）等指标的检测，并进行综合分析以辅助治疗[28]。

4 结语

随着细胞凋亡机制研究的不断完善以及细胞凋亡与骨肉瘤发生关系的不断阐明，人们发现肿瘤细胞凋亡逐渐成为骨肉瘤治疗的一种新策略。通过对细胞凋亡信号通路中的基因、蛋白、受体等靶点对骨肉瘤细胞凋亡进行调节，或通过与放疗、化疗和热疗等方式结合来达到骨肉瘤治疗的目的，都有望提高骨肉瘤治疗的效果。但由于骨肉瘤的发病机制十分复杂，真正将骨肉瘤肿瘤细胞凋亡治疗安全应用于临床，尚需骨肿瘤医师对基础和临床的深入研究与不懈努力。

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R738.1，R329.25

A

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2011-10-12；

2011-11-07）

（本文编辑 白朝晖）

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