海洋软骨鱼软骨抗肿瘤物质的研究进展

冯 刚 ，王 斌 ，罗红宇，曲有乐

（1.浙江海洋学院食品与药学学院，浙江舟山 316004；2.佳木斯大学药学院，黑龙江佳木斯 154007）

恶性肿瘤严重威胁着人类的健康和生命，每年死于癌症的病人约占总死亡人数的四分之一，且发病率呈逐年增长态势，癌症的防治成为医学和生命科学工作者主要研究的课题之一。目前用于癌症治疗的抗肿瘤药物有几十种，但对多数常见实体瘤仍缺乏有效药物，且不少抗肿瘤药在临床应用过程中产生了不同程度的耐药性。因此，筛选高效低毒的抗肿瘤药物成为抗肿瘤新药研发最为重要的任务。

软骨鱼类即软骨鱼纲，是仅存最古老的有颌脊椎动物，主要包括鲨鱼、魟鱼、鳐和银鲛等，是海洋生态系统主要的组成部分之一[1]。上世纪80年代，LEE和LANFER[2]首次发表了鲨鱼软骨含有抗肿瘤血管增生成分的研究论文，后来陆续从鲨鱼软骨中分离得到了多种抗肿瘤活性成分[3]。目前研究表明，软骨鱼软骨的抗肿瘤活性成分主要包括以下三类：（1）多糖：新生血管生成抑制因子、肿瘤细胞抑制因子和免疫调节因子；（2）低分子量蛋白：新生血管生成抑制因子和免疫调节因子；（3）蛋白多糖：新生血管生成抑制因子。本文对软骨鱼类抗肿瘤活性成分的研究进行综述，为其后续开发提供可借鉴的依据。

1 海洋软骨鱼软骨多糖

1.1 软骨多糖新生血管生成抑制因子

1971年，FOLKMAN[4]提出肿瘤生长依赖于血管的学说，后来根据肿瘤血管的生长和分布状况将肿瘤的生长分为血管前期和血管期。在血管前期肿瘤细胞处于休眠状态，肿瘤生长得到明显抑制；而在血管期，肿瘤的新生血管生长活跃，依靠丰富毛细血管网提供活跃代谢环境，肿瘤得以快速生长和转移。如能抑制新生血管生长，则可以抑制肿瘤的生长和转移。因此，以肿瘤血管为靶点的研究是目前肿瘤治疗研究领域的热点。

软骨是一种无血管组织，因对肿瘤侵噬具有一定的抵抗性而能够抑制新生血管的生长[5]。软骨多糖属于糖胺聚糖，是生物体内分布广泛的重要生理活性物质。朱丹等研究表明魟鱼软骨多糖对鸡胚绒毛尿囊膜血管形成具有显著的抑制作用，其可能通过抑制肿瘤血管形成，发挥良好的抗肿瘤活性。姜华茂等[6]发现赤魟Dasyatis akajei软骨多糖膀胱灌注可抑制大鼠原位膀胱肿瘤生长，其机制可能与抑制肿瘤血管生长有关。周莉莉等[7]研究结果显示，鲨鱼软骨多糖可以有效的抑制人脐静脉血管内皮细胞株（HUEVC）的生长，其抑制率达到（45.615±0.084）%，并能有效的抑制鸡胚绒毛尿囊膜的新生血管形成，（PBS对照组血管数目为18.750根，鲨鱼软骨多糖试验组血管数目为7.750±1.545根，差异有统计学意义，P<0.05）；结果提示鲨鱼软骨多糖在抑制内皮细胞生长与新生血管生成方面发挥着重要作用。郭斌等[8]的实验结果表明，赤魟软骨多糖体外能显著抑制血管形成，作用机制可能在于下调VEGF、b-FGF、MMP-9基因和蛋白表达，体内抗肿瘤机制可能是阻断小鼠Lewis肺癌移植瘤模型细胞的细胞周期。

以上研究发现，软骨鱼软骨多糖对肿瘤血管的形成具有显著的抑制作用，可以抑制肿瘤细胞的生长。

1.2 软骨多糖肿瘤细胞抑制因子

近年来，国内外研究证实软骨鱼软骨多糖除了含有血管生成抑制因子，同时含有肿瘤细胞抑制因子。肿瘤细胞抑制因子能够以诱导细胞凋亡的形式清除癌细胞，从而直接抑制肿瘤细胞的生长。

郭斌等[8]从黄点魟Dasyatis gerrardi软骨中提取的粘多糖成分对人T淋巴细胞白血病（CEM）细胞的群体增殖有明显的抑制作用，对小鼠足垫部移植瘤生长抑制作用显著。郭斌和朱丹等研究发现赤魟软骨素对荷瘤小鼠肿瘤的生长和CEM细胞株群体的增殖具有较强的抑制作用，且能够诱导增强CEM细胞表面标志CD2，HLA-I分子的表达。病理学可见，应用低剂量组赤魟软骨多糖的小鼠S-180肿瘤细胞异型性不明显。由此推断，魟鱼软骨多糖具有一定的诱导肿瘤细胞分化的作用。

冯艳红等[9]将赤魟软骨多糖（RCG）应用于膀胱癌EJ细胞研究，发现其诱导细胞凋亡具有时间和剂量依赖性，可将细胞周期阻滞于G2/M期，导致细胞凋亡。

1.3 软骨多糖免疫调节因子

软骨多糖类化合物的抗肿瘤作用，主要在于它能提高宿主的免疫功能，增加免疫细胞的活性。鲨鱼软骨中含有丰富的胺基糖、粘多糖和溶菌酶。胺基糖和粘多糖可以激活免疫系统，活化T、B细胞和巨噬细胞攻击癌细胞的能力，提高机体免疫能力，弥补化疗、放疗后因机体的免疫力低下而造成的抵抗力不足。

朱丹等研究表明赤魟软骨多糖能显著提高荷瘤小鼠胸腺指数和脾指数（P<0.01）；能激活并增强荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能；增强荷瘤小鼠脾细胞IL-2及腹腔巨噬细胞IL-1和TNF产生能力（P<0.05），赤魟软骨多糖对荷瘤小鼠具有明显的免疫增强作用。栾洁等关于鲨鱼软骨粘多糖可以激活免疫系统的研究也表明了上述观点。

综上，软骨鱼多糖抗肿瘤活性物质主要包括新生血管生成抑制因子、肿瘤抑制因子和免疫因子。其中，国内外对新生血管生成抑制因子研究地比较深入，它主要是抑制肿瘤细胞一些酶的活性或一些血管刺激因子而阻止血管内皮细胞的增殖和迁移，从而起到抑制肿瘤细胞的作用。软骨多糖直接来源于动物组织，无明显的毒副作用，体内外实验又显示其具有良好的抗癌活性，有可能成为很有前途的抗癌新药，但其抗癌效果及作用机制则需要进行更加深入的探讨。

2 海洋软骨鱼软骨低分子量蛋白

2.1 软骨蛋白新生血管生成抑制因子

近年来，随着抗血管增生疗法研究的深入，抑制新生血管生成的研究可能成为未来肿瘤治疗的突破口，因此吸引了国内外许多科学家从事该领域的工作。Folkman实验室报道了两种重组蛋白“endostatin”和“angiostatin”，具有非常明显抑制血管生成及肿瘤生长的作用，在国际上引起了轰动[10]。

OIKAWA等[11]从日本鲨鱼软骨中提取得到血管生成抑制因子的相对分子质量在1 000～10 000之间。能够抑制哺乳动物胶原酶、蛋白激酶和胰蛋白酶等的活性，抑制毛细血管上皮细胞的增生和迁移，从而有效地阻止已着床的肿瘤细胞建立新生血管网。尚俊英等[12]从广西北海鲨鱼软骨中得到的小于100kDa低分子蛋白，结果显示该低分子蛋白对血管内皮细胞的生长抑制率为（36.77±2.98）%，黏附抑制率为（52.95±4.48）%，迁移运动抑制率为（68.05±4.04）%，可显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜的新生血管的形成。

我国台湾学者SHEU等[13]从蓝鲨Prionace glauca软骨中分离纯化得到了2条相对分子质量为10 kDa和14 kDa的新血管生成抑制因子U-995，可显著抑制人脐静脉内皮细胞的增殖与迁移，并会引起新血管的中断和破裂，阻止破坏由肿瘤坏死因子TNF-α诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成，防止由胶原酶诱导的胶原溶解。

2000-2001 年，沈先荣等[14]从我国沿海鲸鲨Rhincodon typus软骨中提取分离了2种高度纯化的血管生成抑制因子SCAIF1和SCAIF80，它们的相对分子量分别为18 kDa和8 kDa，并证实为2种新的活性蛋白质。两因子不仅能显著抑制血管内皮细胞的分裂增殖和运动迁移，还能显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成，显著抑制小鼠体内肿瘤的生长，且没有显示任何毒性，具有较好的新药开发前景。

陈建鹤等[15]采用盐酸胍抽提法从中国姥鲨Cetorhinus maximus软骨组织得到相对分子质量为8.3 kDa的蛋白质，对体外血管内皮细胞增殖和体内新生血管生长具有较强的抑制活性，并能显著抑制小鼠移植S180肉瘤的生长。2003年曾锋等[16]从广东阳江鲨鱼软骨中纯化获得分子量为17 400的鲨鱼软骨血管生成抑制因子（SCAI-c），对鸡胚绒毛尿囊膜血管的形成具有显著抑制效应。

罗红宇等[17]从赤魟软骨中获得高纯度的血管生成抑制因子（DCAIF-I）对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管生成具有明显的抑制效果，并具有一定的量效关系。SDS-PAGE-考马斯亮蓝染色显示为一条带,分子量为62 kDa。

郑兰红应用盐酸胍抽提、丙酮分级沉淀、超滤、凝胶层析等分离技术，从青鲨Prionace glauca软骨中分离纯化并鉴定了一种新的血管生成抑制因子。经SDS-PAGE和N-末端氨基酸序列分析显示，分子量为15.5 kDa，采用蛋白数据库分析表明这是一种新发现的鲨鱼软骨蛋白。研究发现无毒或低毒的PG155是一个具有显著的抗新生血管生成蛋白，提示其可能开发成为一个新型的抗肿瘤药物。

上述研究表明软骨鱼软骨蛋白的血管生成抑制因子主要是通过抑制胶原酶、蛋白酶和胰蛋白酶等的活性，阻止血管内皮细胞的增殖和迁移，从而有效阻止已着床的瘤细胞建立新生血管网络，达到阻断肿瘤细胞的氧气和营养物质来源的目的，使之保持在无血管静止状态。此外抗血管增生活性物质一般不会引起耐药性[18]。ROBERT等[19]认为血管生成抑制剂是无抗性的抗肿瘤药，因为其作用于肿瘤的重要靶区为遗传性相当稳定的血管内皮细胞。同时近年来许多学者和研究人员把目光转移至鲨鱼软骨血管抑制因子，包括anti-MMPs[20]、anti-VEGF[21]、细胞凋亡因子[22]和TPA等[23]，它们通过拮抗内皮细胞生长因子、下调内皮细胞生长因子受体、内皮细胞表面黏附分子和促进内皮细胞凋亡等综合作用抑制新生血管的形成。

由于不同的研究者采用不同的分离提取方法，使蛋白降解程度不同，进而得到了分子质量各异的具有血管生成抑制活性的降解物。如Luer[24]发现鲨软骨的蛋白质提取物中有6～7种蛋白质能抑制肿瘤血管生长，而Folkman认为鲨鱼软骨中有13种活性蛋白质能抑制肿瘤血管生长。因此学术界对此项研究尚未有固定的标准。

2.2 海洋软骨低分子量蛋白免疫调节因子

我国古代就有中药典籍记载鲨鱼软骨有提高人体免疫力的作用。王劲等[25]根据祖国医学对鲨鱼药用功效的记载，结合现代对鲨鱼软骨的认识，探讨了鲨鱼软骨抗癌增效及调节免疫功能的作用。结果表明，鲨鱼软骨可明显提高荷瘤小鼠的NK细胞活性并增强其M动细胞的吞噬能力，其与化疗药物（CTX、SFU、ADM）合用可提高抗肿瘤作用，证实鲨鱼软骨具有较好的扶正（提高免疫功能）作用和明显的抗癌增效作用。

1964年，SAVA等[26]应用溶菌酶治疗10例晚期癌症患者取得了一定的治疗效果。后续研究发现，溶菌酶的抗肿瘤活性是通过增强机体的免疫功能这一途径实现的，其在体内可以象单核因子和淋巴因子那样，调节淋巴细胞和巨噬细胞介导的细胞毒作用[27]。陈建鹤[28]等从中国姥鲨软骨组织获得介导溶菌酶活性的高纯度蛋白质（Sp15，分子量15.2 kDa），并首次完成了N-末端22个氨基酸残基序列的测定；该研究也首次表明，鲨鱼软骨组织的抗肿瘤作用不仅仅是由新生血管抑制因子所介导，软骨源溶菌酶样分子（Sp15）至少亦参与介导了部分的抗肿瘤活性。同时Sp15具有极强的抑制体外血管内皮细胞增殖活性。以往的溶菌酶抗肿瘤研究都局限于鸡蛋清源溶菌酶，该研究为抗肿瘤研究开辟了新的道路。

HASSAN等[29]从角鲨Heterodontus Francisci中分离纯化得到了分子量为14 kDa和15 kDa两种蛋白质的一个低分子量组分，该组分具有大多数免疫激活效应，能够增强免疫系统反应，活化NK细胞及巨噬细胞以增强攻击癌细胞的能力，并能抑制新生血管生成。海洋软骨鱼软骨蛋白的免疫调节因子主要是一类小分子蛋白。据报道，溶菌酶分子可作为一种较强的免疫调节因子而用于预防和治疗恶性肿瘤。与此同时，国内对海洋软骨鱼软骨蛋白的免疫调节作用研究并不多，需要进行更加详细深入的研究。

3 海洋软骨抗肿瘤蛋白多糖类

科学家认为，由于不同的研究者采用不同的分离提取方法，使蛋白多糖大分子的降解程度不同，进而得到了分子质量各异的具有血管生成抑制活性的降解物[30]。

王路等[31]从姥鲨软骨中提取分离到了一种碱性的亲水性糖蛋白（含糖量8%），对胶原酶、内皮细胞DNA合成和血管生成均有明显抑制作用，但对肿瘤细胞无直接的杀伤和抑制作用。由于其抑制胶原酶的活性属竞争性抑制，因此推测其结构可能与胶原酶相似。2000年美国加州大学的LIANG和WONG[32]从长尾鲨Thresher Sharks软骨中分离纯化得到血管生成抑制因子SCF2，SCF2是一种含有硫酸角质素和多肽的热稳定性蛋白多糖，对培养的内皮细胞具有特异的血管生成抑制活性。上述研究表明虽然海洋软骨鱼软骨蛋白多糖的降解程度不同，但均能有效的抑制血管生成从而抑制肿瘤生长。

4 展望

软骨鱼软骨的抗肿瘤机制是多样的，除了新生血管生成抑制因子、肿瘤细胞抑制因子和免疫调节因子外，还有抗入侵因子、调节前列腺素和血栓素的水平以及抗氧化作用。其中对新生血管生成抑制因子、肿瘤细胞抑制因子和免疫调节因子的研究比较深入，而对抗入侵因子、调节前列腺素和血栓素的水平以及抗氧化作用的研究还需要进一步的探索。软骨鱼软骨的毒副作用小且抗癌作用明显，成为未来抗癌领域的有效药物指日可待。

[1]WOURMS J P,DEMSKI L S.The reproduction and development of sharks,skates,rays and ratfishes:introduction,history,overview,and future prospects[J].Environmental Biology of Fishes,1993,38(1/3):7-21.

[2]LEE A,LANGER R.Shark cartilage contains inhibitors of tumor angiogenesis[J].Science,1983,221(4 616):1 185-1 187.

[3]EISENSTEIN R,SORGEN N,SOBLE L W,et al.The resistance of certain tissue to invasion[J].Am K Pathol,1973,73(3):765-774.

[4]FOLKMAN J.Tumor angiogenesis:therapentic implications[J].N Engl J Med,1971,285(21):1 182-1 186.

[5]MOSES M A,SUDALTER J.LANGER R.Isolation and characterization of an inhibitor of neovascularization from scapular chondrocytes[J].Cell Biol,1992,119:475.

[6]姜华茂,郭 斌,孔垂泽,等.魟鱼软骨多糖对大鼠膀胱肿瘤生长的抑制作用中[J].华中医药学刊,2008,26(6):1 190-1 191.

[7]周莉莉,李志革,尚俊英,等.鲨鱼软骨多糖抑制肿瘤生长的实验研究[J].中华肿瘤防治杂志,2009,16(8):592-595.

[8]郭 斌,唐金中,贾玉海,等.魟鱼骨素抗肿瘤作用的初步研究[J].辽宁中医杂志,2002,29(6):368-369.

[9]冯艳红,郭 斌,姜华茂.等.魟鱼软骨多糖诱导膀胱癌细胞凋亡的实验研究[J].中华中医药学刊,2008,26(6):1 198-1 200.

[10]O'REILLY M S,BOEHM T,SHING Y,et al.Endostatin:An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth[J].Cell,1997,38:277-285.

[11]OOKAWA T,ASHINO-FUSE H,SHIMAMURA M,et al.A novel angiogenic inhibitor derived from Japanese shark cartilage(I).Extraction and estimation of inhibitory activities toward tumor and embryonic angiogenesis[J].Cancer Lett,1990,51(3):181-186.

[12]尚俊英,谢裕安,杨 帆.鲨鱼软骨低分子蛋白的提取及其抑制新生血管形成的初步研究[J].广西医学,2008,30(2):156-158.

[13]SHEU J R,FU C C,TSAI M L,et al.Effect of U-995,a potent shark cartilage-derived angiogenesis inhibitor,on anti-angiogenesis and anti-tumor activities[J].Anticancer Res,1998,18(6A):4 435-4 441.

[14]沈先荣,吉冬梅,贾福星,等.鲨鱼软骨血管生成抑制因子的纯化与功能[J].生物化学与生物物理学报,2000,32(1):43-48.

[15]陈建鹤,焦炳华,缪为民,等.中国姥鲨软骨源新生血管抑制因子(Sp8)的分离纯化及生物学活性[J].第二军医大学学报,2000,21(2):107-110.

[16]曾 锋,杨伟兴,崔昆燕.17400鲨鱼软骨血管生成抑制因子的纯化及生物学活性研究[J].高等学校化学学报,2003,24(9):1 588-1 591.

[17]罗红宇,余新威,钱 晓.赤魟软骨血管生成抑制因子的纯化及抗血管生成活性验证[J].水产学报,2007,31(6):814-817.

[18]BOEHM T,FOLKMAN J,BROWER T,et al.Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance[J].Nature,1997,390:404-407.

[19]ROBERT S K.A cancer therapy resistant to resistance[J].Nature,1997,390(6 658):335-336.

[20]FALARDEAU P,CHAMPAGNE P,POYET P,et al.Neovastat,a naturally occurring multifunctional antiangiogenic drug in phaseⅢclinical trials[J].Semin Oncol,2001,28(6):620-625.

[21]BELIVEAU R,GINGRAS D,KRUGER E A,et al.The antiangiogenic agent Neo-vastat(AE-941)inhibits vascular endothelial growth factor-mediated biological effects[J].Clin Cancer Res,2002,8(4):1 242-1 250.

[22]BOIVIN D，GENDRON S，BEAULIEU E，et al.The antiangiogenic agent Neovasat（AE-941）induces endothelial cell apoptosis[J].Mol Cancer Ther,2002,1(10):795-802.

[23]GINGRAS D,LABELLE D,NYALENDO C,et al.The antiangiogenic agent Neovasat(AE-941)stimulates tissue plasminogen activator activity[J].Invest New Drug,2004,22(1):17-26.

[24]吴汉斌,史叶龙,瞿发林.鲨鱼软骨的抗癌研究进展[J].河北中西医结合杂志,1998,7(11):1 694-1 696.

[25]王 劲,杨 仆,张建雄,等.鲨鱼骨粉抗癌增效及调节免疫功能的研究[J].第二军医大学学报,2000,74(2):14-17.

[26]SAVA G,CESCHIA V,PACOR S.Mechanism of the antineoplastic action of lysozyme:evidence for host mediated effects[J].Anticancer Research,1989,9(4):1 175-1 180.

[27]WARREN J S,RINEHART J J,ZWILLING B S,et al.Lysozyme enhancement of tumor cell immunoprotection in a murine fibrosarcoma[J].Cancer Res,1981,41(5):1 642-1 645.

[28]陈建鹤,焦炳华,缪为民,等.中国姥鲨软骨源溶菌酶样分子的分离纯化、部分氨基酸序列测定及体内抗肿瘤活性研究[J].药物生物技术,2000,7(2):77-81.

[29]HASSAN Z M,FEYZI R,SHEIKHIAN A,et al.Low molecular weight fraction of shark cartilage can modulate immune responses and abolish angiogenesis[J].Int Immunopharmacol,2005,5:961-970.

[30]贾福星,沈先荣.鲨鱼软骨血管生成抑制因子的研究进展[J].解放军药学学报,2002,18(1):34-37.

[31]王 路,焦炳华.鲨鱼软骨中新生血管抑制因子的分离纯化及活性的初步研究[J].第二军医大学学报,1996,17(2):176-180.

[32]LLANG J H,WONG K P.The characterization of angiogenesis inhibitor from shark cartilage[J].Adv Exp Med Bio,2000,476:209-223.