从中药材女贞子中提取药效成分齐墩果酸最佳工艺研究*

张来新，赵卫星，杨 琼

（宝鸡文理学院 化学化工系，陕西 宝鸡 721013）

中药女贞子又名冬青子（为冬青树之果实），系木犀科女贞属植物女贞的成熟果[1]，主产于浙江、江苏、湖南、河南、四川、陕西等地。我市街巷、路边、校园、公园等女贞子树随处可见，故女贞子的采集容易、价廉易得。女贞子的有效成分主要有齐墩果酸、女贞子多糖、氨基酸、磷脂及挥发油等，其中含量最多者为齐墩果酸，用高效液相色谱法测定果皮果肉含量高达14%～17%。齐墩果酸（Oleanolic Acid OLA）又名庆四素，系五环三萜类化合物[2]，其结构式为：

齐墩果酸主要具有护肝肾[3，4]、降脂、促进肝细胞再生、抗病毒、抗炎、强心、利尿、抗肿瘤等作用[5-7]，不仅如此，还具有降血糖、降血脂、镇静作用[8-10]，是补肝肾和开发治疗肝病和降血糖等药物有效成分[11]，特别是抗艾滋病毒活性的发现，也是非常可喜的苗头[12]。这些都说明齐墩果酸具有广阔的应用和开发前景。

由于齐墩果酸结构复杂，难以用化学方法合成，近年来大多从植物中提取[13]。目前，国内主要的提取方法有：（1）醇提酸水解法，该法操作简便，但收率不高；（2）醇提-酸碱反复处理法，该法损失量大，收率也不高；（3）发酵-酸碱反复处理法，该法耗时较长。因此，能否提取分离得到高纯度的齐墩果酸直接影响到其更深层次的研究和应用。针对上述问题，我们设想用一种新的方法，就齐墩果酸的提取分离及性质鉴定进行研究，以求得探索提取高纯度和高产率齐墩果酸较为理想的方法。

1 女贞子中提取齐墩果酸的实验原理及方法

五环三萜类化合物齐墩果酸不溶于水，可溶于乙醇、氯仿、丙酮，熔点为310℃。根据其理化性质设计的提取方法是：先将女贞子在超声波中破碎处理，然后高压蒸煮，再经过搅拌器使果皮、果肉（提取的精原料）与种皮、种仁分离，后用70%乙醇超声波提取齐墩果酸，提取后用酸和碱交替处理，并加盐盐析沉淀→酸处理→活性炭脱色→正己烷脱脂→95%乙醇重结晶得白色针状物齐墩果酸。

2 实验部分

2.1 实验原料

实验用女贞子采集于校园女贞树的干燥成熟果实女贞子（据前人经验，女贞子生长为黄褐色采摘较佳[1]，元旦左右采集为宜）。

2.2 仪器及试剂

R系列旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；调温加热电热套（河南爱博特科技发展有限公司）；循环水式多用真空泵（SHB-B郑州长城科工贸公司）；752-C型紫外分光光度计（上海第三分析仪器厂）；Savant Modulyo冻干机（美国Thermo电子公司）；仪表恒温水浴锅（上海申光仪器仪表有限公司）；XSZ-G型普通光学显微镜（重庆光电仪器有限公司）；KQ-250B型超声波仪（昆山市超声仪器有限公司）；显微熔点测定仪（北京中西远大科技有限公司）。

本实验所用的各种溶剂和试剂均为分析纯；齐墩果酸标准品（中国药品生物制品鉴定所）。

2.3 齐墩果酸的提取方法

2.3.1 女贞子果皮果肉与种皮种仁的分离 有关实验研究表明，齐墩果酸在女贞子中含量占总重量的1.4%，而女贞子果皮、果肉中齐墩果酸含量高达14%～17%，但种皮种仁中齐墩果酸含量极少[4]。故为了提高齐墩果酸的提取率，在实验前先将女贞子粉碎，再将齐墩果酸含量高的果皮果肉与种皮种仁分离。提取实验主要用齐墩果酸含量高的果皮果肉为原料。这样做一方面可以提高齐墩果酸的提取率，另一方面按操作相同数量的女贞子求算，可使实验设备体积大大缩小，从而提高实验或生产效率、减少能耗和溶剂用量，并使生产或实验过程中齐墩果酸损失量大大降低。

2.3.1.1 原料女贞子的蒸煮处理 将干燥干净的女贞子1.5kg常温下放置在超声波容器中超声（200W）破碎1h，然后用无菌水浸泡45min，滤去水分后在高压锅中施于156906Pa蒸气压力下蒸煮1h。高压蒸煮其目的之一是为灭活酶，另一方面是易于果皮果肉（以下简称皮渣）与种皮种仁的分离。

2.3.1.2 分离皮渣与种皮、种仁 把已蒸煮过的原料女贞子移入盛有1500mL水的搅拌桶内，装好搅拌器，转速为2500～2800r·min-1，搅拌使果皮被打下，并在水中形成糊状物。随后将糊状物移入水选槽中，启动离心泵使其水液循环，由于皮渣的密度较小，而种仁、种皮的密度较大，因之在体系循环水的作用下皮渣浮于上层，而种皮、种仁沉于下层。而后水流将皮渣带出排出口，再经120目尼龙筛过滤皮渣与水分离，并收集皮渣。

2.3.2 皮渣中齐墩果酸的提取 将皮渣置于3L的提取器中，然后放在超声波容器（200W）中，加入70%乙醇，600℃回流提取3次，每次50min，合并3次提取液，水浴蒸发浓缩至粘稠状物质。

2.3.3 齐墩果酸粗产品的分离纯化 取上述粘稠状物质，按1∶1加水稀释并加入浓盐酸调节pH值为1，此时齐墩果酸等酸性物质析出，经抽滤得到齐墩果酸粗品。然后将齐墩果酸粗品溶于7倍体积水中，加NaOH溶液调节pH值至11～12煮沸40min，然后将500g食盐加入其中冷却至室温进行盐析，这时齐墩果酸钠盐又重新沉淀析出，而其它有机酸钠盐等则留在母液中，随后抽滤将析出的齐墩果酸钠盐沉淀。将纯化过的齐墩果酸钠盐再溶于水，加入盐酸酸化并调节pH值至1～2，冷却静置过夜，抽滤可得到固体齐墩果酸中间品。将该中间品用热蒸馏水洗脱至无Cl-，随后将齐墩果酸沉淀物用6～8倍体积的无水乙醇热溶解，其溶液中存在黄褐色物质，并有少量胶状悬浮物存在，为此加入十分之一的活性炭煮沸25min过滤，溶液中有部分杂质被活性炭吸附，使溶液颜色变淡，趁热抽滤，滤液冷却静置过夜得黄色沉淀，抽滤得微黄色沉淀物。将该沉淀物置索氏提取器滤纸套筒中，加入适量正己烷脱脂，得白色沉淀。该白色沉淀再经95%乙醇重结晶得到白色针状结晶提取物齐墩果酸纯品。

3 结果与讨论

3.1 结果

3.1.1 提取物齐墩果酸物理常数测定 将提取的齐墩果酸纯品用显微熔点测定仪测定其熔点为：308～310℃，与手册值一致；测定其比旋光度与手册值一致。

3.1.2 齐墩果酸提取率的计算 精确称取一定量的干基原料，用无水乙醇溶解并定容，按照果皮果肉含量15%计算。最终按下式计算提取率：

齐墩果酸提取率（mg/g）=重结晶后提取的齐墩果酸的质量（mg）/女贞子果皮果肉质量（g）

3.1.3 产品紫外分析表明 女贞子提取物在560nm出现明显紫外吸收，与齐墩果酸在560nm处的特征吸收峰相符合。

3.2 单因素对齐墩果酸提取率的影响

3.2.1 乙醇体积分数的影响 在液固比20∶1，超声波功率300W，提取温度60℃，超声波作用时间50min的条件下，改变乙醇体积分数，按上述操作提取，结果见表1。

表1 乙醇体积分数对提取率的影响Tab.1 Influence of ethanol content on extraction rate

由表1可知，齐墩果酸提取率随乙醇体积分数的增加而提高。即由于齐墩果酸为弱极性分子，溶于乙醇而不溶于水，故提取溶液中乙醇含量越高，溶剂极性越弱，齐墩果酸提取率越高。当乙醇体积分数超过70%后，齐墩果酸提取率增加缓慢，但是此时需消耗较多的乙醇。综合分析上述情况，实验中选择乙醇体积分数为70%为宜。

3.2.2 超声波功率对齐墩果酸提取率的影响 在乙醇体积分数为70%、液固比20∶1、提取温度60℃、超声波作用时间50min的条件下，改变超声波的功率，其实验结果见表2。

表2 超声波功率对提取率的影响Tab.2 Influence of microwave power on extraction rate

由表2可知，超声波功率在300W以下，齐墩果酸提取率上升，当超声波功率超过300W后，齐墩果酸提取率缓慢下降。这是因为超声波功率太低时，超声对细胞膜的破坏作用较小。齐墩果酸溶出速率慢，因而提取率较低。功率过高时，可能由于局部温度会瞬间升高，使齐墩果酸的结构破坏，反而使提取率降低。故选择超声波功率200W为最佳。

3.2.3 提取温度的影响 在乙醇体积分数为70%、超声波功率200W，液固比20∶1，超声作用时间50min的条件下，改变提取温度，其实验结果见表3。

表3 提取温度对提取率的影响Tab.3 Influence of temperature on extraction rate

从表3我们不难看出，随着温度的升高，提取率逐渐升高，当温度高于60℃后，提取率开始下降。究其原因可能在温度过高时，部分齐墩果酸的结构被破坏，提取率下降。故综合分析其最佳温度60℃为宜。

3.2.4 液固比的影响 在乙醇体积分数70%，超声波功率200W、提取温度60℃、超声波作用时间为50min的条件下，改变液固比，其实验结果见表4。

表4 液固比对提取率的影响Tab.4 Influence of liguid-solid ratio on extraction rate

由表4可知，随着提取剂用量的增加，提取率逐渐增大。溶剂用量的增加使齐墩果酸在细胞壁内外扩散的浓度差增大，以提高其扩散速率而增加提取率。但当液固比达到20∶1后，基本不增加。说明液固比达到20∶1时，齐墩果酸提取已经比较完全，可能因原料中的齐墩果酸含量逐渐减少，浓度差减小或消失，越来越难溶出。故液固比宜选为20∶1。

3.2.5 超声波作用时间的影响 在乙醇体积分数为70%、超声波功率200W、液固比20∶1、提取温度60℃条件下，改变超声波作用时间，其实验结果见表5。

表5 超声波作用时间对提取率的影响Tab.5 Influence of time on extraction rate

由表5可知，随着时间的增加，提取率逐渐增大，但超过50min后，齐墩果酸提取率呈下降趋势。究其原因可能是齐墩果酸由于超声波作用受热时间过长而使其结构被破坏。因此，提取时间以50min为宜。

综上所述，从女贞子中提取齐墩果酸的最佳条件为：（1）液固比为 20∶1；（2）超声波的功率为200W；（3）提取温度为 60℃；（4）乙醇体积分数为 70%；（5）时间为超声波作用50min为宜。

3.3 讨论

3.3.1 提取前果皮、果肉与种皮、种仁分离的优点 本实验采用先将女贞子在超声波中破碎处理，然后高压蒸煮，再通过搅拌器使种皮、种仁与果皮、果肉分离，并结合超声提取齐墩果酸，结果使设备利用率提高，设备体积缩小、能耗降低、有机溶剂用量减少、提取过程产品齐墩果酸的损失量减少，从而节约了成本，提高了提取效率及经济效益。彰显了该工艺的优越性，故该法是一个重要的创新。

3.3.2 本实验采取超声波提取的优点 超声波提取法较之于常规提取法具有提取时间短、简单、收率高等优点。提取后用酸和碱交替处理，并加盐脱水析出齐墩果酸，然后重结晶。实验结果表明提取率大大提高，故我们称此法为“酸沉碱溶盐析”处理法。

3.3.3 齐墩果酸的盐析理论依据 齐墩果酸属萜类化合物中的五环三萜酸类物质，在女贞子果实等植物中以游离酸的形式存在，其羧酸钠盐的形成使其极性增强，故有类似于肥皂的表面活性剂的作用。鉴于此特性，依据胶体化学理论，故在其提取液中加盐脱水（即盐析）是提取纯化过程中行之有效的好方法。故我们称其为“酸沉碱溶盐析法”。该法实验操作简单易行，效果优良，成本低廉，适于工业化生产。

3.3.4 女贞子采摘时间 女贞子生长为黄褐色采摘较佳[1]。研究表明，女贞子果实中齐墩果酸的含量随产地不同和成熟程度的不同而异。一般说来，成熟程度好的女贞子外观为紫黑色，研究表明该种女贞子中色素成分和其它杂质的含量很高，尤其是绿色色素在酸碱介质中与齐墩果酸有类似的理化性质，故将它们与齐墩果酸分离较为困难。实践证明，提取齐墩果酸的女贞子果实采摘的最佳时间为黄褐色，因为此时女贞子果实中绿色色素含量很低，而褐色素则含量较高。但褐色色素则易溶于pH值为8～10水相中，故其该杂质易与提取物齐墩果酸分离。

3.2.5 女贞子中齐墩果酸含量15%左右见参考文献[1]，该论文所用的方法优于参考文献所提到的其它方法，其优点是找到了最佳提取工艺和最佳提取条件，并提高了提取率。

4 小结

高纯度齐墩果酸提取的最佳工艺为：干燥女贞子果实→皮仁分离→70%乙醇超声波提取（3次，每次50min）→酸沉淀（pH值为1～2）→碱处理（pH值为11～12）→盐析→酸处理（pH值为1～2）→活性炭脱色→正己烷脱脂→冷却干燥→95%乙醇重结晶→白色针状结晶（产品）。该工艺简便易行、提取率高、能耗小、溶剂损失小，有推广应用价值。

［1］马忠先,蒲家志,孙志勇.女贞子中提取齐墩果酸的实验方法［J］.遵义医学院学报,2003,26（5）:473-475.

［2］李群林,顾军,李灵芝.齐墩果酸衍生物的合成［J］.合成化学，2010,18（3）:290-296.

［3］吕佳飞,李文飞,冯伟,等.微波法提取红枣中齐墩果酸的工艺条件优化研究［J］.化工技术与开发,2010,39（6）:21-24.

［4］陈秋实,吴杰,李威,等.从木瓜成叶中提取齐墩果酸及羟丙基-β- 环糊精包合工艺研究［J］.中药材,2010,3（5）:804-806.

［5］刘智华.女贞子齐墩果酸的提取及其降血糖作用研究［D］.陕西杨凌:西北农林科技大学,2007.

［6］吴林蔚,蒲蔷,陈晓珍,等.齐墩果酸对卵巢癌细胞IGROVl和乳腺癌细胞MDA-MB-231生长的抑制作用［J］.应用与环境生物学报，2010,16（2）:202-204.

［7］赵龙铉,贺兴隆,金礼吉,等.齐墩果酸和甘草次酸衍生物的合成与表征及抗癌活性研究［J］.辽宁师范大学学报（自然科学版）,2010,33（4）:474-476.

［8］张明发,沈雅琴.齐墩果酸和熊果酸的抗糖尿病药理［J］.上海医药,2010,31（8）:347-349.

［9］吕佳飞,李文飞,冯伟,等.微波法辅助提取石榴皮中齐墩果酸的工艺条件优化研究［J］.食品与发酵科技,2010,46（2）:41-44.

［10］周巧霞,顾振纶.山楂中熊果酸和齐墩果酸的高效液相色谱分析［J］.中成药,2010,32（5）:862-864.

［11］杨胜丹,付大友,谭文渊,等.超声-微波协同萃取川木通中齐墩果酸的工艺研究［J］.应用化工,2010,39（1）:87-89

［12］全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编［C］.北京:人民卫生出版社,1975.137.

［13］孙旭群,吴正红,李燕.齐墩果酸分散片的制备研究［J］.安徽医药,2010,14（9）:1013-1015.