基质金属蛋白酶-9对斑块稳定性的影响及强力霉素的干预效果

李学远 夏 豪 (武汉大学人民医院心血管内科，湖北 武汉 430060)

基质金属蛋白酶-9对斑块稳定性的影响及强力霉素的干预效果

李学远1夏 豪 (武汉大学人民医院心血管内科，湖北 武汉 430060)

目的 探讨基质金属蛋白酶-9(MMP-9)与大鼠动脉粥样硬化斑块稳定性的关系及强力霉素的干预效果。方法 36只雄性Wistar大鼠随机分为对照组(C组)、动脉粥样硬化组(A组)和强力霉素干预组(D组)，A组和D组给予高脂饲料+维生素D3腹腔注射，D组同时予强力霉素10 mg·kg－1·d－1腹腔注射一次。于第14周确定造模成果后测量血清MMP-9、血浆超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平，取主动脉石蜡包埋切片，HE染色，观察斑块形态，计数易损斑块数目。结果 D组血MMP-9、hs-CRP水平均低于A组(P＜0.01，P＜0.05)，而高于C组(P＜0.01);各组MMP-9与hs-CRP水平呈正相关(r=0.928，P＜0.01)。D组血管内膜/中膜面积比及易损斑块计数较A组均降低(P＜0.05，P＜0.01)。结论 强力霉素可以通过抑制MMP-9活性达到稳定动脉粥样硬化斑块的作用。

基质金属蛋白酶-9;斑块稳定性;强力霉素;C反应蛋白

易损斑块破裂、出血及形成血栓是急性冠脉综合征发病的主要机制〔1〕。研究显示易损斑块内基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达明显增加，致基质胶原合成与降解失衡，降解多于合成〔2〕，是造成斑块纤维帽变薄，斑块溃疡或破裂的重要因素。MMP-9由斑块内的巨噬细胞、单核细胞等炎症因子分泌，高敏C反应蛋白(hs-CRP)是反应体内炎症活动的敏感性指标，目前认为MMP-9与hs-CRP联合检测可评价预测斑块稳定性的指标。本文应用MMPs抑制剂强力霉素干预动脉粥样硬化大鼠MMP-9的活性表达，并检测血清MMP-9水平及hs-CRP水平变化，观察动脉粥样硬化斑块形态，以探讨MMP-9与斑块稳定性的关系及强力霉素的干预效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物、仪器与试剂 健康纯种雄性Wistar大鼠36只(SPF级)武汉大学人民医院动物实验中心提供，体重220～260 g。MMP-9 ELISA试剂盒购于TPInIc公司，免疫组化染色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，高速离心机(德国Eppendorf公司)、紫外分光光度计(日本Shimadzu公司)、电子天平由武汉大学心血管病学实验室提供。强力霉素粉购于Sigma公司，实验时以0.9%生理盐水按2∶1比例配成注射液。

1.2 模型建立与分组 36只大鼠随机分为对照组(C组)、动脉粥样硬化组(A组)和强力霉素干预组(D组)。C组只给予普通饮食，A组和D组每天给予按“3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙硫氧嘧啶、5%白糖、10%猪油、81.3%基础饲料”配制的高脂饲料约20 g，饮水不限，喂食开始时腹腔注射维生素D3 70万IU/kg，分3 d给完，每隔1个月追加一次维生素 D3 30万/kg。D组在造模同时每天一次腹腔注射强力霉素10 mg/kg，C组和A组给予等剂量0.9%生理盐水处理。于喂养12 w后处死A组大鼠一只，甲醛固定胸主动脉，石蜡包埋，连续切片，切片固定于载玻片上，HE染色，光学显微镜示粥样硬化的病理特征出现，确定造模成功，进行下一步实验。

1.3 指标测定 于第14周给予3%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，暴露心脏，开胸取左心室腔血 2 ml，4℃3 000 r/min离心10 min后取血清，双抗体夹心ABC-ELISA法检测MMP-9水平，采用酶法并用全自动生化分析仪测定血清hs-CRP水平;取升主动脉起始部约2～3 cm左右的动脉段于10%中性甲醛溶液固定，常规脱水、固定、透明、包埋、切片，进行HE染色，光镜观察形态学特点，应用图像分析仪测量内膜、中膜厚度，计算内膜/中膜面积比(I/M)。

1.4 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件包处理，计量数据采用±s表示，行方差分析，各组均数间两两比较采用Student-Newman-Keuls法，计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 血清MMP-9及hs-CRP水平 D组血清MMP-9、hs-CRP水平均明显低于A组(P＜0.01)，但明显高于C组(P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清学指标水平(±s)

表1 各组大鼠血清学指标水平(±s)

与C组比较:1)P＜0.05;与A组比较:2)P＜0.05

组别 n MMP-9(μg/ml) hs-CRP(μg/ml)10 0.57±0.21 518.04±53.98 A组 10 5.16±0.891) 1 436.31±59.911)D组 10 1.59±0.551)2) 924.56±69.311)2)C组

2.2 HE染色结果 光镜下观察，C组主动脉管腔完整光滑，各层结构清晰;A组和D组管腔均明显变窄，内膜明显增厚，中膜平滑肌细胞排列紊乱，A组内膜内含大量泡沫细胞及炎症细胞，D组可见钙化斑块形成。将脂质核心大于斑块40%者判定为易损斑块，A组易损斑块数及斑块I/M明显高于D组和C组(P＜0.01)，而 D组与 A组间无统计学差异(P＞0.05)，见表2。

表2 各组易损斑块数及I/M比较

3 讨论

急性冠脉综合征的发生绝大部分是由其斑块的稳定性而非斑块的大小决定的〔1〕，近来提出的易损斑块即是指在结构和功能上具有易损性并可能快速进展成为罪恶斑块的那些粥样硬化病变。本研究根据Naghavi等〔3〕的标准将脂质核心大于斑块体积40%以上者判定为易损斑块。MMPs是一类活性依赖于锌离子和钙离子的蛋白水解酶类，主要的生理功能是降解ECM 成分，如胶原、明胶、弹性蛋白等〔4～6〕，MMP-9是其中的一种，即明胶酶B，MMP-9能直接降解内皮基质，使斑块纤维帽变薄从而削弱斑块稳定性〔7，8〕。研究表明急性冠脉综合征患者血清MMP-9水平明显升高，且证实是冠脉内斑块破裂释放入血循环引起〔9〕。本研究证实了MMP-9水平与斑块稳定性密切相关，其水平升高可以作为判定斑块不稳定的血清学指标之一。

强力霉素属四环素类抗生素，大剂量时具有抗菌作用，而在小剂量时能螯合金属离子从而起到抑制MMPs的活性的作用〔10，11〕。本研究以 10 mg·kg－1·d－1的小剂量强力霉素作用与动脉粥样硬化大鼠模型后，发现与动脉粥样硬化组比较，其血脂水平无明显变化，但血清MMP-9水平明显降低，稳定斑块数增加，提示强力霉素可以通过抑制MMP-9的活性而增强斑块稳定性，且这一作用与血脂的代谢水平无关。有研究显示，MMP-9除能直接降解基质降低斑块纤维帽强度外，还可能参与了斑块内新生血管的生成，而新生血管又可增加斑块内炎症细胞因子的侵入，活化的炎性细胞又可分泌生长因子和释放MMPs，由此激发了正反馈机制，促进斑块的发生发展，甚至诱发斑块内出血和斑块破裂〔12〕。本研究发现，强力霉素虽不能直接抑制MMP-9的合成，但强力霉素组MMP-9水平仍明显降低，可能与强力霉素抑制了MMP-9的活性后，阻断上述正反馈机制有关。

目前普遍认为动脉粥样硬化是动脉壁对脂质沉积的一种炎症纤维增生性反应〔13〕，而hs-CRP被公认是反映体内炎症活动的敏感性指标，并且可以作为判断斑块的稳定性的间接指标〔14〕。本研究中，强力霉素组血清hs-CRP水平较动脉粥样硬化组显著降低，而其易损斑块数也明显降低，这与刘海波〔15〕等通过冠状动脉造影发现血清CRP水平与斑块形态特征存在正相关的报道相一致，表明强力霉素干预能够增强斑块稳定性，减少斑块内炎症活动。而强力霉素减少炎症活动的作用是由于阻断了上述正反馈机制，抑或本身即具有抗炎作用所致目前尚不明确，有待进一步研究。

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R543.31

A

1005-9202(2011)12-2282-02

1 黄石市第二医院

夏 豪(1966-)，男，主任医师，博士生导师，主要从事冠心病防治研究。

李学远(1980-)，男，硕士，主要从事心血管疾病的诊治研究。

〔2010-06-18收稿 2010-09-20修回〕

(编辑 刘 愉/曹梦园)