老龄与年轻大鼠脑出血后星形胶质细胞反应的比较

孟凡超 孙世龙 娄季宇 赵亚鹏 (郑州市第三人民医院神经内科，河南 郑州 450000)

老龄与年轻大鼠脑出血后星形胶质细胞反应的比较

孟凡超1孙世龙 娄季宇1赵亚鹏 (郑州市第三人民医院神经内科，河南 郑州 450000)

目的 观察年龄对脑出血后星形胶质细胞反应的影响。方法 年轻(3个月龄)和老龄(16个月龄)雄性SD大鼠脑内注入100μl自体全血，观察与年龄相关的神经胶质细胞的反应。年轻、老龄模型组大鼠分别在脑内注血后6、12、24、72 h、7、14 d时间点处死动物(每组6只)进行GFAP免疫组化。假手术组作对照。观察GFAP染色的阳性细胞表达。结果 与年轻大鼠比较，老龄大鼠脑出血后3 d星形胶质细胞的反应较弱，GFAP阳性细胞数显著低于年轻大鼠，这种状况可持续到监测14 d(P＜0.01)。结论 老龄大鼠脑出血应答的星形胶质细胞反应较弱，老龄是影响脑出血后脑损伤的重要因素。

脑出血;胶质纤维酸性蛋白;星形胶质细胞;脑损伤;大鼠

增殖过程中幼稚的星形胶质细胞(AS)先表达中间丝波形蛋白(valentine)，成熟后则表达胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。GFAP是完成反应性AS胶质化的必要条件，是AS主要成分，可作为AS的特异性标记物及其活化的标志〔1〕，反映细胞各种分子物质表达的改变及代谢变化。研究证实，AS在脑出血后血肿周围发生肥大和增生性变化，其变化对神经元的生长和存活可能有促进作用〔2〕。但老龄是否影响脑出血后脑损伤及AS反应，目前尚未在动物模型方面进行系统研究。本文通过动物实验探讨年龄对脑出血后AS反应的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器、试剂 Narishige型立体定向仪(日本)，微量进样器(上海医用激光仪器厂)，显微外科手术器械(上海医疗器械厂)，奥林巴斯显微镜(日本)。SP免疫试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、GFAP抗体、GFAP二抗(北京中杉生物技术有限公司)。

1.2 实验动物与分组、脑出血模型建立、标本制备 参照既往实验研究〔3〕。年轻 (3个月龄)和老龄 (16个月龄)雄性SD大鼠脑内注入100μl自体全血，分别在脑内注血后6、12、24、72 h、7、14 d时间点处死动物 (每组6只)进行GFAP免疫组化。假手术组作对照。GFAP免疫组化染色步骤 (SP法)严格按说明书操作。磷酸盐缓冲液 (PBS)代替一抗作为阴性对照。

1.3 阳性细胞的辨认和测定 GFAP为AS的胞质、突起着色，免疫组化阳性细胞显色为棕黄色。计数方法:对每张玻片取5个高倍镜视野，计数5个高倍视野内的阳性细胞总数，计算每高倍视野下阳性细胞均数。

1.4 统计学分析 应用SPSS10.0统计软件，所有数据均采用±s表示，采用Student t检验。

2 结果

正常脑组织GFAP阳性细胞数量少，突起细短，染色淡，细胞轮廓清晰，规律排布。脑出血12 h后GFAP阳性细胞数量开始增加。72 h～7 d阳性细胞数量进一步增多，体积大，突起增粗，阳性颗粒颜色加深。7 d AS的反应达高峰，阳性细胞明显增多，胞体肥大，突起粗大不规则，呈簇状分布。14 d GFAP阳性反应减弱。与年轻大鼠比较，老龄大鼠脑出血后72 h星形细胞的反应相对较弱。见图1、图2。

图1 同侧皮质区GFAP阳性细胞数(±s)

图2 同侧基底节区GFAP阳性细胞数(±s)

3 讨论

AS活化是AS可塑性的具体表现，又称反应性胶质增生是中枢神经系统在许多病理生理情况下常见反应，表现为AS胞体肥大、肿胀、突起增多延长、GFAP表达增强等。Kajihara等〔4〕研究发现脑损伤后7～15 d AS反应达高峰，细胞体积明显增大，突起明显增粗，数目变多，为活化状态的AS。本研究显示老年、年轻大鼠脑出血早期GFAP阳性AS表达较低，72 h时明显升高，7 d达高峰，14 d下降。表明脑出血GFAP阳性AS表达存在时间依赖性变化。在对犬的成年组和老龄组观察发现〔5〕:随着机体衰老，齿状回分子层GFAP免疫反应性显著降低，而在CA1却是升高的，且GFAP免疫反应阳性细胞胞体明显肥大，提示不同年龄阶段、不同区域GFAP表达也不同。有学者〔6，7〕用缺口末端标记法(TUNEL)和免疫组化法观察到受伤的脊髓中存在凋亡，认为AS增多是增殖和迁移积聚多于死亡所致。本实验老龄大鼠脑出血后GFAP阳性AS表达较弱，可能是老龄大鼠脑出血损伤后AS凋亡增多所致，提示老龄是影响脑出血损伤AS凋亡增多的因素。

研究证实，AS在脑出血周围区发生肥大和增生性变化，其变化对神经元的生长和存活可能有促进作用〔2〕。本研究显示老龄、年轻大鼠脑出血早期AS表达较弱，推测脑出血早期AS的反应是对神经元损伤的应答，与维持神经元存活有关。老龄大鼠较年轻大鼠脑出血后AS表达弱，可能是老龄大鼠脑出血损伤后AS的凋亡增多及年龄依赖性的AS神经保护功能反应性降低所致。

活化后的AS通过多种途径与神经元、胶质细胞等相互作用，发挥多种功能。Seth等〔8〕认为，AS的功能很多，包括控制突触的形成和功能、大脑血管张力的调节、免疫调节、成年时的神经生长。AS能调节突触的传播和可塑性。Haber等〔9〕发现，AS能够非常快地伸出和缩回很细的突起，接触或脱离能动的突触后树状突起。AS的能动度依赖于其细胞骨架中肌动蛋白的重组作用。Haydon等〔10〕认为，在许多突触处，一个AS的突起能与突触前和突触后神经元的突起联系，故这个突触结构就命名为“三联突触”，这些AS就能够影响突触的传播。激活后AS对神经元的影响包括两方面:一方面，通过分泌大量的神经营养因子、细胞因子和基质分子促进轴突再生，保护神经元免受损伤，有利于损伤后神经元的功能恢复。反应性胶质增生的细胞有合成神经营养因子的能力，能影响神经元总体在受损组织中的命运。AS可合成和释放多种神经营养因子，如神经生长因子(NGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，层黏连蛋白，纤维黏连蛋白及其他细胞外基质成分，有维持神经元存活和促进神经突起生长的作用。另一方面，对神经元修复有其不利的一面。(1)不能提供适当的神经再生基质。成年鼠单侧切断其黑质纹状体束，术后2 d在损伤区无AS存在，4 d后可见损伤区边缘有一些AS，10 w后在坏死空洞区有致密的AS网状组织存在，芽生反应由高峰开始衰减时，AS反应上升。所以急性损伤后新生的AS支持轴突再生，但稍后当反应性升高时表现为负性作用，抑制再生。尽管在中枢神经系统(CNS)发育中AS为神经元的迁移和神经纤维的靶向性延伸充当基质，但成熟动物的反应性AS却是一种不适合轴突生长的环境。(2)反应性AS同时也能分泌对轴突生长和神经元存活的抑制性分子。例如细胞黏合素(tenasin)对抑制轴突生长、发育和再生中引导髓鞘化和神经细胞的迁移方面起作用，并能促进星形胶质瘢痕的形成。与tenasin-R连接的硫酸软骨素蛋白多糖可以促进少突胶质细胞的移动性和诱导胶质瘢痕形成。本实验老龄较年轻大鼠脑出血后AS表达较弱，可能是老龄大鼠脑出血损伤后AS神经保护功能反应性降低，以及神经元、胶质细胞等不适当相互调节作用所致。由于脑损伤后AS对损伤神经元的作用具有两面性，一方面活化的AS可以保护损伤的神经元;另一方面，活化的AS又可以加重神经元的损伤，所以在分析脑损伤后AS作用的时候，脑损伤的类型、年龄以及检测损伤的时间是必须考虑的因素。

实验表明不同类型脑损伤后AS的反应不同，活化AS在形态上的差异可能与神经营养因子的运输、神经修复与再生等功能相适应〔11〕。年龄依赖性的神经元活动变化引起细胞外K+、神经递质和神经调质浓度的变化，从而增加AS活动，导致GFAP表达和 AS 改变〔12〕。Fountoulakis〔13〕和丁勤学等〔14〕利用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2DE)技术发现:老龄鼠脑组织液中蛋白发生了质和量的变化，蛋白结构修饰、氨基酸突变，降解碎片增多等。这些实验均提示:年龄依赖性的变性蛋白可能是引起AS活化的重要因素。本实验老龄较年轻大鼠脑出血后AS弱表达可能有上述机制参与。AS是神经元存活的要素，在当前的研究中，脑出血应答的AS反应在老龄大鼠较弱。老龄大鼠对脑损伤有较少AS的反应，也有研究发现老龄脑缺血大鼠AS反应较强〔15，16〕。然而，脑出血应答的GFAP阳性AS反应在老龄大鼠是否具有神经保护作用仍有争论。本研究认为老龄大鼠更严重的脑损伤很可能与脑出血应答的AS反应较弱有关。

1 Dietrich WD，Danton G，Hopkins AC，et al.Thromboembolic events predispose the brain to widespread cerebral infarction after delayed transient global ischemia in rats〔J〕.Stroke，1999;30(4):855-61.

2 Sugawara T，Lewen A，Noshita N，etal.Effectsofglobal ischemia duration on neuronal，astroglial，oligodendroglial，and microglial reactions in the vulnerable hippocampal CAl subregion in rats〔J〕.JNeurotrauma，2002;19(1):85-98.

3 孟凡超，娄季宇.老年与年轻大鼠脑出血后小胶质细胞反应的比较〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(22):3310-3.

4 Kajihara H，Tsutsumi E，Kinoshita A，et al.Activated astrocytes with glycogen accumulation in ischemic penumbra during the early stage of brain infarction:immunohistochemical and electron microscopic studies〔J〕.Brain Res，2001;909(1-2):92-101.

5 Hwang IK，Choi JH，Li H，et al.Changes in glial fibrillary acidic protein immunoreactivity in the dentate gyrus and hippocampus proper of adult and aged dogs〔J〕.JVet Med Sci，2008;70(9):965-9.

6 Crowe MJ，Bresnahan JC，Shuman SL，et al.Apoptosis and delayed degeneration after spinal cord injury in rats and monkeys〔J〕.Nat Med，1997;3(1):73-6.

7 Li GL，Brodin G，Farooque M，etal.Apoptosis and expression of Bcl-2 after compression trauma to rat spinal cord〔J〕.JNeuropathol Exp Neurol，1996;55(3):280-9.

8 Seth P，Koul N.Astrocyte，the star avatar redefined〔J〕.JBiosci，2008;33(3):405-21.

9 Haber M，Zhou L，Murai KK.Cooperative astrocyte and dendritic spine dynamics at hippocampal excitatory synapses〔J〕.J Neurosci，2006;26(35):8881-91.

10 Haydon PG，Blendy J，Moss SJ，et al.Astrocytic control of synaptic transmission and plasticity:a target for drugs of abuse〔J〕?Neuropharmacology，2009;56:83-90.

11 杨 忠，李红丽，蔡文琴，等.两种不同脑损伤后星形胶质细胞反应性变化的比较研究〔J〕.第三军医大学学报，2001;23(9):1074-7.

12 Berciano MT，AndresMA，Calle E，etal.Age-induced hypertrophy of astrocytes in rat supraoptic nucleus:a cytologicalmorphometric，and immunocytochemical study〔J〕.Anat Rec，1995;243(1):129-44.

13 Fountoulakis M，Hardmaier R，Schuller E，et al.Difference in protein level between neonatal and adult brain〔J〕.Electrophoresis，2000;21(3):673-8.

14 丁勤学，阙海平.成年和老年小鼠脑蛋白质组双向电泳图谱比较〔J〕.生物化学与生物物理进展，2001;28(5):683-7.

15 Kharlamov A，Kharlamov E，Armstrong DM.Age-dependent increase in infarct volume following photochemically induced cerebral infarction:putative role of astroglia〔J〕.JGerontol A Biol Sci Med Sci，2000;55(3):B135-B141.

16 Badan I，Buchhold B，Hamm A，et al.Accelerated glial reactivity to stroke in aged rats correlates with reduced functional recovery〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2003;23(7):845-54.

R743.3

A

1005-9202(2011)12-2272-03

1 郑州大学第二附属医院神经内科

娄季宇(1954-)，男，教授，博士生导师，主要从事脑血管疾病临床研究。

孟凡超(1965-)，男，副主任医师，主要从事脑血管疾病临床研究。

〔2011-03-30收稿 2011-04-20修回〕

(编辑 袁左鸣/徐 杰)