NGF诱导PC12细胞分化晚期的蛋白质组学研究

侯 澍 张 磊 李红杰 胡林森 (首都医科大学附属北京世纪坛医院神经内科，北京 0008)

NGF诱导PC12细胞分化晚期的蛋白质组学研究

侯 澍 张 磊1李红杰2胡林森3(首都医科大学附属北京世纪坛医院神经内科，北京 100038)

目的 研究神经生长因子(NGF)诱导PC12细胞分化晚期的细胞蛋白质组变化，探索NGF诱导细胞分化的分子机制。方法50 ng/m l NGF作用于PC12细胞96 h，提取细胞总蛋白，应用荧光差异凝胶电泳(DIGE)获取蛋白点的差异表达信息，运用MALDI-TOF质谱鉴定出差异蛋白质。结果 NGF诱导96 h后，共有58个蛋白点发生变化，质谱鉴定出了10种蛋白。结论 本实验首次应用DIGE技术筛选NGF诱导PC12细胞分化晚期的相关蛋白，其中5种蛋白是首次在NGF诱导的PC12细胞中被报道。这些蛋白可能是NGF信号转导过程的新成员，也可以成为药物治疗的新靶点。

蛋白质组学;DIGE;NGF;PC12细胞

神经生长因子(NGF)是最早被发现和分离纯化的多肽生长因子，是神经营养因子(NT)家族的典型代表。本研究应用蛋白质组学技术筛选NGF诱发PC12细胞分化的相关蛋白，旨在寻找NGF信号转导过程的新成员，为深入进行神经保护药物的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 PC12细胞购自中国科学院上海细胞库，DMEM购自Gibco公司，NGF购自厦门北大之路生物工程有限公司。尿素、硫脲、CyDye荧光标记物(Cy2，Cy3，Cy5)、赖氨酸、24 cm固相pH梯度干胶条pH3-10NL、甘油、SDS、IAA等均购自GE Healthcare-Biosciences公司。Ultrospec 3300 pro分光光度计、Ettan DALT Six电泳系统、Typhoon 9400系列多功能激光扫描成像系统以及基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)均由GE Healthcare-Biosciences公司提供。

1.2 NGF诱导PC12细胞分化晚期模型的建立 DMEM培养基中含体积分数为10%新生牛血清、1%谷氨酰胺、100μg/ml青霉素、100μg/m l链霉素，PC12细胞于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞长至90%接触时进行传代，选取对数生长期细胞进行实验研究。

将细胞按1×105个/ml密度接种，实验组中加入50 ng/ml NGF、对照组中加入等体积培养液。给药后96 h进行吖啶橙和溴化乙啶染色，观察细胞形态变化，并计数分化的细胞(每孔随机计数300个细胞，其中突起的长度超过胞体直径2倍者计为阳性，长出多个突起的细胞只计数1次，至少计数3个孔)。

1.3 蛋白质组学分析和差异蛋白质的鉴定 选取四批不同代数的细胞，设为实验组(T1～4)和对照组(C1～4)，实验组中加入50 ng/m l NGF、对照组中加入等体积培养液，再培养96 h。收取细胞蛋白质，纯化后定量。T1～4、C1～4各取50μg分别放入8个离心管中;再取T1～4、C1～4各25μg制成内标。如表1所示进行分组，分别以1μl CyDye(Cy3、5)工作液标记相应的蛋白样品，用4μl Cy2工作液标记内标。分组后，按既定程序进行双向电泳，然后进行凝胶图像扫描与分析。

表1 样品分组及内标构成

同样的方法进行制备胶的电泳，然后应用考马斯亮蓝染色及MALDI-TOF-MS质谱仪进行蛋白质的鉴定。

2 结果

2.1 NGF作用96 h PC12细胞的形态学变化 见图1。NGF作用后观察PC12细胞形态学的变化，并与对照组进行比较。NGF作用96 h后，细胞变得扁平，呈梭形或多角形，胞体增大，48%的细胞长出长突起，不同细胞的突起可连接成网。显微镜下细胞计数，NGF作用96 h后实验组阳性细胞约占细胞总数的48%，相应对照组阳性细胞约占2.4%。

图1 对照组与NGF处理组PC12细胞的形态(吖啶橙和溴化乙啶染色，×200)

2.2 NGF诱导96 h的差异蛋白质组分析 双向电泳之后，实验组和对照组的蛋白质斑点分布模式基本一致，所获12张蛋白质胶图平均含有(2 234±76)个点。以Cy2图像为标准，与其他各图谱相匹配，匹配率约为88.1%。用软件分析NGF诱导PC12细胞分化晚期(96 h)的蛋白质表达，发现实验组与对照组相比有58个蛋白点表达量显著改变，经过质谱鉴定，获得其中10个蛋白质的明确质谱信息，见图2、图3及表2。其中NF-M、NF-L、α-tubulin 2、tubulin β-15、annexin Ⅴ、TM 等 6 个蛋白表达上调，而VCP、TH、RNA解旋酶、GST等4个蛋白表达下调。如图2A所示点d的5个蛋白质点分子量相当，等电点间隔相同，而且各点的质谱鉴定结果完全一致，提示这一列蛋白点为发生不同程度修饰的同一蛋白。

图2 NGF诱导PC12细胞96 h的蛋白质组学分析图谱

图3 蛋白点h的MALDI-TOF-MS鉴定结果

表2 NGF作用96 h后差异表达蛋白的质谱鉴定结果

3 讨论

蛋白质组学技术的关键在于蛋白质的分离和鉴定，二维电泳(2DE)是目前分离蛋白质的主要手段，但是传统的2DE技术灵敏度较低，结果可靠性、重复性较差。DIGE技术〔1〕在传统双向电泳技术的基础上，结合了多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，极大地提高了结果的准确性、可靠性和重复性，被认为是目前定量蛋白质组学研究中可信度和准确率最高的技术之一。

本实验中，NGF作用PC12细胞96 h后，共发现58个表达量变化的蛋白点，质谱获得其中10种蛋白质的明确信息。其中有5种结构蛋白，即 NF-M、NF-L、α tubulin-2、tubulinβ-15和TM，他们的表达均增高，参与构成微管、微丝及中间丝蛋白等细胞结构。

蛋白点 b为含缬酪肽蛋白(valosin-containing protein，VCP)，是三磷酸腺苷酶超家族中的一员，又称黑色素转铁蛋白或p97。VCP的底物多样〔2〕，包括有丝分裂的细胞周期蛋白以及细胞周期蛋白激酶抑制剂p27、原癌基因产物p53、c-myc、c-Jun、I-κB等。因而VCP在膜融合、细胞分裂周期调控、细胞内蛋白的运输和调控以及细胞凋亡等活动中均发挥着重要作用。

蛋白点d被鉴定为TH，该酶是儿茶酚胺类神经递质合成过程中的限速酶，催化酪氨酸转变成L-多巴，胶质细胞源性神经营养因子能够诱导中脑源干细胞表达TH〔3〕。有报道显示，低浓度(1μg/ml)NGF作用早期，交感神经元内TH水平下降，此时NGF主要通过细胞表面受体促使轴突的形成;而高浓度NGF(100μg/ml)则通过神经末梢摄取和轴突的逆向转运到达胞体，诱导TH表达和细胞生存〔4〕。本实验应用的NGF浓度为50 ng/ml，远远低于引起TH表达所需的NGF浓度，推测这是TH表达下调的主要原因。

经质谱鉴定，蛋白点h为膜联蛋白Ⅴ。膜联蛋白具有抑制磷脂酶A2及蛋白激酶C活性、参与细胞骨架活动、参与磷脂化与膜受体的功能调节、抗凝、传导有丝分裂信号以及促进细胞分泌等重要生理功能〔5〕。本研究中实验组的膜联蛋白Ⅴ表达显著增高，其在NGF诱导PC12细胞分化过程中的具体作用还需进一步探索。

蛋白点g经质谱鉴定证实为RNA解旋酶，此酶能够使双链RNA解链，作用于RNA-蛋白复合体使其中RNA解离。细胞内RNA转录、加工剪接及核糖体组装都需要解旋酶的参与〔6〕。本实验在NGF诱导PC12细胞分化的蛋白质组学研究中检测到RNA解旋酶的表达降低35%。推测此时ATP水解耗能减少，以节约能量用于细胞分化过程。

点j为GST Y-b亚单位，GST是细胞抗损伤、抗癌变的重要解毒酶系，主要催化还原型谷胱甘肽(GSH)与亲电子化合物的结合，使后者失去结合DNA的活性，在代谢环境致癌物和化疗药物中发挥重要作用〔7〕。在本实验中，检测到GST含量降低，这可能与NGF诱导的PC12细胞分化过程有关。

综上所述，本研究应用DIGE技术结合MALDI-TOF质谱分离鉴定了一批在NGF处理的PC12细胞中表达发生显著改变的蛋白。这些蛋白可能是NGF信号转导过程的新成员，也可以成为药物治疗的新靶点。

1 Yan JX，Devenish AT，Wait R，etal.Fluorescence two-dimensional difference gel electrophoresis and mass spectrometry based proteomic analysis of Escherichia col〔i J〕.Proteomics，2002;2(12):1682-98.

2 Partridge JJ，Lopreiato JO Jr，Latterich M，et al.DNA damage modulates nucleolar interaction of the Werner protein with the AAA ATPase p97/VCP〔J〕.Mol Biol Cell，2003;14(10):4221-9.

3 姜 宇，曾水林，鲁佑瑜，等.胶质细胞源性神经营养因子促进中脑源神经干细胞增殖和向多巴胺能神经元分化〔J〕.神经解剖学杂志，2010;26(5):537-42.

4 Hill CE，Hendry IA.Differences in sensitivity to nerve growth factor of axon formation and tyrosine hydroxylase induction in cultured sympathetic neurons〔J〕.Neuroscience，1976;1(6):489-96.

5 刘 懿，凌诒萍，钟慈声.annexin钙依赖的磷脂结合蛋白在细胞分泌中的作用〔J〕.生理科学进展，1997;4:367-9.

6 Luking A，Stahl U，Schmidt U.The protein family of RNA helicases〔J〕.Crit Rev Biochem Mol Biol，1998;33(4):259-96.

7 Yang G，Shu XO，Ruan ZX，et al.Genetic polymorphisms in glutathione-S-transferase genes(GSTM1，GSTT1，GSTP1)and survival after chemotherapy for invasive breast carcinoma〔J〕.Cancer，2005;103(1):52-8.

Q503

A

1005-9202(2011)12-2267-03

1 吉林大学第二医院儿科 2 长春市中心医院神经内科

3 吉林大学第一医院神经内科

胡林森(1949-)，男，教授，博士生导师，从事神经变性病的机制研究。

侯 澍(1978-)，女，医师，博士，从事神经系统血管性疾病的机制和治疗研究。

〔2010-10-20收稿 2011-02-25修回〕

(编辑 徐 杰)