FKN对外周血单个核细胞ERK1/2活化和TNF-α表达的影响及ERK1/2的临床作用

雷明明 孙 健 张学颖 金元哲 (中国医科大学附属第四医院心内科，辽宁 沈阳 0032)

FKN对外周血单个核细胞ERK1/2活化和TNF-α表达的影响及ERK1/2的临床作用

雷明明 孙 健1张学颖 金元哲 (中国医科大学附属第四医院心内科，辽宁 沈阳 110032)

目的 探讨趋化因子(FKN)对单个核细胞细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1/2和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)表达的影响及ERK1/2在其中的作用。方法 抗凝血用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。将每份提取的单个核细胞分为3组:空白对照组、FKN组、FKN+PD98059(ERK特异性阻断剂)组;分别应用Western印迹法和酶联免疫法检测各组单个核细胞中磷酸化ERK1/2及TNF-α的表达水平。结果 FKN诱导组磷酸化的ERK1/2和TNF-α表达较空白组显著增多(P＜0.05);PD98059组磷酸化的ERK1/2和TNF-α表达较FKN组显著减少(P＜0.05)。结论 FKN-CX3CR1可能通过增加单个核细胞磷酸化ERK1/2和TNF-α的表达而促进动脉粥样硬化的进展，FKN可能是通过ERK1/2途径诱导单个核细胞TNF-α的表达。

动脉粥样硬化;FKN;ERK1/2;肿瘤坏死因子

最近发现炎性内皮细胞释放一种新的趋化因子(fractalkine，FKN)，与自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、淋巴细胞上的受体趋化因子(CX3CR1)结合以后，可以增强NK细胞的杀伤力，导致血管内皮细胞损伤;同时使单核细胞、淋巴细胞向血管内皮细胞趋化、黏附，从而促进动脉粥样硬化(AS)的形成。目前，关于此趋化因子信号传导机制尚不清楚，还没有实验证实FKN/CX3CR1系统引发的细胞内分子水平反应。本实验针对FKN/CX3CR1引发的细胞内信号传导机制研究FKN-CX3CR1、细胞外信号通路1/2(ERK1/2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)之间的上下游关系，并探讨ERK1/2在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人外周血浓缩白细胞、低糖DMEM(LGDMEM，Gibco)，优等胎牛血清(FBS，Hyclone)，Ficoll分离液(浓度1.077 g/ml，Pharmacia)，胰酶、乙二胺四乙酸(EDTA)(Promega)，兔抗人磷酸化ERK1/2单克隆抗体(R＆D Systems)，山羊抗兔抗体(IgG，Santa Cruz)，人TNF-αELISA定量检测试剂盒(北京博蕾德生物科技有限公司)，重组人FKN(PeproTech Inc)，ERK特异性阻断剂PD98059(ALEXIS)，兔抗β-tubulin抗体(Santa Cruz)，化学荧光剂(ECL)试剂盒(上海国药集团化学试剂有限公司生命科学部)。

1.2 方法

1.2.1 分离人外周血单个核细胞 无菌条件，Ficoll密度梯度离心法从人外周浓缩白细胞中分离人单个核细胞。

1.2.2 Western印迹方法检测单个核细胞磷酸化ERK1/2的含量 Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC)并计数后，将1×107个单个核细胞(2 m l)/孔铺于六孔板中，实验分组如下:①空白对照组:单个核细胞中加入抑制剂溶媒对照，37℃、5%CO2培养箱中孵育2 h后，加入FKN溶媒对照，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育45 min。②FKN组:在单个核细胞中加入抑制剂溶媒对照，37℃、5%CO2培养箱中孵育2 h后，加入 FKN(终浓度为0.5 μg/ml)，37℃、5%CO2培养箱中孵育45 min。③FKN+PD98059组:在单个核细胞中加入PD98059(终浓度为50 μmol/L)，37℃、5%CO2培养箱中孵育2 h后，加入 FKN(终浓度为 0.5 μg/ml)，37℃、5%CO2培养箱中孵育45 min。按照常规Western印迹方法对上述各组ERK1/2和β-tubulin进行检测。结果判定:磷酸化ERK1/2相对积分光密度值=磷酸化ERK1/2条带积分光密度值/β-tubulin条带积分光密度值。

1.2.3 ELISA方法检测单个核细胞培养上清中TNF-α含量

1.2.3.1 分组 用含10%FBS的RPMI1640培养液调整人外周血单个核细胞浓度至5×106个单个核细胞/m l，接种于96孔板中，每孔200μl，实验分为3组，每组2个复孔:①空白对照组:单个核细胞中加入抑制剂溶媒对照，37℃、5%CO2培养箱中孵育2 h后，加入FKN溶媒对照，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h。②FKN组:在单个核细胞中加入抑制剂溶媒对照，37℃、5%CO2培养箱中孵育2 h后，加入FKN(终浓度为0.5μg/m l)，37℃、5%CO2培养箱中孵育 24 h。③FKN+PD98059组在单个核细胞中加入 PD98059(终浓度为50 μmol/L)，37℃、5%CO2培养箱中孵育 2 h后，加入 FKN(终浓度为 0.5 μg/ml)，37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h。

1.2.3.2 ELISA法检测各组培养上清中TNF-α含量 收集各组单个核细胞的培养上清，按免疫酶标试剂盒说明书操作:①标准品配制:取标准品1支加500μl标准品液，混匀，全部吸出加入另一支标准品中(A:500 pg/ml)，取1 m l小离心管7支(B、C、D、E、F、G、H)，分别加入250 μl标准品液，H 管为零对照管，从A管吸取250μl加入B管，混匀(B:250 pg/ml)，依次倍比稀释至 G 管(C:125 pg/ml，D:62.5 pg/m l，E:31.25 pg/ml，F:15.6 pg/ml，G:7.8 pg/ml，H:0 pg/m l)。②加样:样品孔，每孔加100μl血清;标准品孔，每孔加100μl标准品，均做2复孔，37℃2 h。③洗板:300μl/孔1×清洗液，甩去，在干净的吸水纸上拍干。如此洗3遍。④加检测抗体:100μl/孔，37℃2 h，洗板同③，洗4遍。⑤加酶结合物:100μl/孔，37℃ 30 min。洗板同③，洗5遍。⑥显色:显色液A 50μl/孔，显色液B 50μl/孔(先加A液再加B液，不得先加B液，也可等量的A液与B液混合，100μl/孔)，37℃ 30 min(从加B液算时间)。⑦终止:终止液100μl/孔，按显色液加样顺序加样。⑧测值:测定各孔450 nm的OD值。⑨绘制标准曲线:以标准品浓度值(pg/ml)为横坐标，以所测标准品的OD值为纵坐标。利用各样品孔测得的OD值，从标准曲线上查相应的浓度值，以pg/ml表示。

1.3 统计学方法 应用SPSS15.0统计软件进行处理，实验数据以±s表示，采用Bartlett法证明各组方差齐性后，采用方差分析和Newman-Keuls-q检验进行组间两两比较。

2 结果

2.1 Western印迹检测单个核细胞内ERK1/2表达 各组细胞内均有磷酸化ERK1/2的表达，FKN组与空白组相比，条带颜色明显加深，光密度值增加(1.811 2±0.068 2 vs 0.723 0±0.110 2)，差异有统计学意义(P＜0.05)。PD98059组磷酸化的ERK条带较FKN组颜色有不同程度变浅，光密度值(1.287 6±0.082 8)减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图1。

图1 W estern印迹检测各组单个核细胞内ERK 1/2表达

2.2 ELISA法检测 TNF-α表达结果 FKN刺激24 h后，TNF-α 表 达 〔(206.686 1 ± 7.979 0)pg/m l〕较 空 白 组〔(112.159 6±7.366 2)pg/ml〕增加，差异有统计学意义(P＜0.05);应用PD98059预刺激2 h后，再加入FKN孵育24 h组TNF-α 表达〔(63.894 7±1.577 3)pg/m l〕较FKN 组减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

3.1 FKN-CX3CR1对AS的影响及其机制 FKN是新发现的一种在AS斑块中过量表达的趋化因子，在AS形成过程中参与炎症反应，用膜结合型FKN刺激NK细胞，或FKN表达细胞与NK细胞共培养可诱导干扰素 γ(IFN-γ)表达〔1〕，而且 FKN能与新分离的NK结合，以剂量依赖的方式增强NK的杀伤力，从而导致内皮细胞损伤〔2〕，同时 FKN可以介导表达其受体CX3CR1的单核细胞、淋巴细胞、血管平滑肌细胞(VSMC)等向损伤的血管内皮细胞黏附、趋化，并能跨越血管壁向血管外特定部位迁移，FKN还可以促进血小板的活化，Barlic等发现氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)和氧化型亚油酸以FKN浓度依赖的方式诱导单核细胞与冠状动脉VSMC的异常黏附〔3〕，从而在AS的进展中发挥作用。Ikejima等人发现，FKN-CX3CR1的表达可能导致冠状动脉粥样斑块的破裂〔4〕。.因此，FKN被认为是AS的危险因素之一。经实验证明，趋化因子FKN介导的促白细胞黏附过程并不需要其他黏附分子，其可通过与受体CX3CR1结合兼有介导细胞黏附与趋化的功能〔5，6〕。

目前，还没有实验确切证实FKN/CX3CR1系统引发怎样的细胞内分子水平反应，继而促进AS的形成。TNF对血管内皮细胞可产生直接细胞毒作用〔7〕，从而破坏内皮细胞结构和功能的完整性，致内皮细胞大片脱落，造成血管内皮细胞损伤，导致内皮细胞分泌活性物质平衡失调，内皮素(ET)合成和释放增多。通过以上可以看出，TNF-α可能在AS形成中发挥着很重要的作用。经实验发现，FKN处理组TNF-α表达值较空白组显著增高。说明FKN可使单个核细胞TNF-α表达增加，推测FKN-CX3CR1促进AS形成的机制之一可能是通过增加单个核细胞TNF-α表达而实现的。

研究表明ERK通路的激活与应激刺激、细菌产物、炎症介质等引起的细胞反应亦存在着密切关系。ERK分子所涉及的通路在心肌细胞中具有重要作用，不仅涉及心肌细胞的信号传导、生长等生理过程，与心肌细胞的肥厚和凋亡等病理过程也密切相关。Hu等〔8〕发现，球囊损伤后早期血管组织ERKl/2活性升高，同时伴有c-fos和c-jun的mRNA的升高;在损伤后7～14 d，内膜的 ERK1/2仍然升高，并且内膜高于中膜，提示ERK1/2活性和两种癌基因表达的增加可能参与了再狭窄过程;Yang等〔9〕报道，ox-LDL在导致培养 VSMC增殖的同时，伴随促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)的活化，并可诱导ERKl/2的活化。可以看出，ERK可能在AS形成中发挥着很重要的作用。实验发现，FKN处理组磷酸化ERK1/2含量较空白组显著增加。结果说明FKN可使单个核细胞磷酸化ERK1/2表达增加，推测FKN-CX3CR1促进AS形成的机制之一可能是通过增加单个核细胞表达磷酸化ERK1/2而实现的。

3.2 ERK1/2在FKN-CX3CR1影响AS信号传导机制中的作用 研究证实，CX3CR1属于G-蛋白耦联受体〔10〕。目前国内外大量试验已经明确证实:G-蛋白能将与其耦联的受体与其相应效应酶如:蛋白激酶A、蛋白激酶C、磷脂酶C等联结起来，进而通过效应酶产生相应的生物学效应。许多研究表明PKC可以通过 Ras途径和 PI3K途径激活 ERK(MAPK)，但 FKNCX3CR1是否可以通过上述途径，即通过激活PKC而促进ERK的活化呢?此前的研究表明，FKN-CX3CR1可以通过G-蛋白与PKC相耦联后，诱导单个核细胞核转录因子(NF-κB)和TNF-α的表达〔10〕，从而促进 AS的形成。以上实验结果说明 FKN/CX3CR1-G蛋白-PKC-ERK之间可能存在一系列的级联反。

磷酸化激活的ERKl/2可调节某些转录因子的活性，进一步调节它们各自靶基因的转录，引起特定蛋白的表达或活性改变，最终调节细胞代谢和功能，影响细胞产生特定的生物学效应。除此之外，还可以调节NF-κB和转录激活蛋白-1(Ap-1)等转录因子的转录活化，活化的NF-κB可通过调节各种黏附分子、炎性分子及趋化因子而在AS的形成中发挥作用。本实验应用ERK抑制剂PD98059来阻断ERK作用，研究探讨ERK和TNF-α之间的关系，也即ERK信号途径是否参与了FKN诱导引起的单个核细胞内信号传导机制。实验结果发现:PD98059组TNF-α表达值较FKN组明显减少。PD98059组与空白组比较，TNF-α的浓度亦明显减少。结果说明，ERK在 FKNCX3CR1诱导单个核细胞表达TNF-α的过程中发挥极其重要的作用，阻断ERK后，TNF-α的浓度明显减少。结合此前的实验研究，推测:FKN-CX3CR1系统可能通过 G-蛋白与效应酶PKC偶联，活化后的PKC使ERK磷酸化，后者活化后进入细胞核，直接调节或者通过影响特定的转录因子，如NF-κB而间接的影响单个核细胞对TNF-α表达，最终促进AS的形成和发展。

1 Yoneda O，Imai T，Nishimura M，et al.Membrane-bound form of fractalkine induces IFN-γ production by NK cells〔J〕.Eur J Immunol，2003;33(1):53-8.

2 Yoneda O，Imai T，Gouda S，et al.Fractalkine-mediated endothelial cell injury by NK cells〔J〕.J Immunol，2000;164(8):4055-62.

3 Barlic J，Zhang Y，Murphy PM.Atherogenic lipids induce adhesion of human coronary artery smoothmuscle cells tomacrophages by up-regulating chemokine CX3CL1 on smoothmuscle cells in a TNFα-NFκB-dependent manner〔J〕.JBiol Chem，2007;282(26):19167-76.

4 Ikejima H，Imanishi T，Tsujioka H，et al.Upregulation of fractalkine and its receptor，CX3CR1，is associated with coronary plaque rupture in patientswith unstable angina pectoris〔J〕.Circ J，2010;74(2):337-45.

5 Imai T，Hieshima K，Haskell C，etal.Identification andmolecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1，which mediates both leukocyte migration and adhesion〔J〕.Cell，1997;91(4):521-30.

6 Umehara H，Bollm ET，Okazaki T，et al.Fractalkine and vascular injury［J］.Trends Immunol，2001;22(8):602-7.

7 Schger L，Varahi J，Marks RM，et al.Cytotoxicity of tumor necrosis factorα for human umbilical vein endothelial cells〔J〕.lab Invest，1989;61(11):62-8.

8 Hu Y，Cheng L，Hochleither BW.Activation ofmitogen-activated protein kinases(ERK/JNK)and AP-1 transcription factor in rat carotid arteries after balloon injury〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997;17(11):2808-16.

9 Yang CM，Chiu C，Wang CC，etal.Activation ofmitogen-activated protein kinase by oxidizedlow-denslty lipoprotein in canine cultured vascular smooth muscle cells〔J〕.Cell Signal，2000;12(4):205-14.

10 孙 健，李淑梅，郑柳颖，等.FKN影响动脉粥样硬化信号传导机制及G蛋白在其中作用的研究〔J〕.中国老年学杂志，2007;27(6):533-5.

R541.4

A

1005-9202(2011)12-2264-03

吉林省科技发展计划项目资助(2007052351)

1 吉林大学第一医院心内科

金元哲(1965-)，男，教授，主任医师，主要从事心脏病介入治疗的研究。

雷明明(1982-)，男，硕士，医师，主要从事冠心病基础研究。

〔2011-04-11收稿 2011-04-22修回〕

(编辑 袁左鸣/徐 杰)