延衰合剂对D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠睾丸及血清睾酮的影响

黄和贤 曹文富 彭 爽 栾增强 (重庆医科大学附属第一医院中西医结合科，重庆 400016)

延衰合剂对D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠睾丸及血清睾酮的影响

黄和贤 曹文富 彭 爽 栾增强 (重庆医科大学附属第一医院中西医结合科，重庆 400016)

目的 观察延衰合剂(YSM)对D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠睾丸及血清睾酮的影响。方法 选昆明系雄性小鼠，用D-半乳糖建立衰老模型。应用光镜、电镜技术观察延衰合剂治疗前后衰老小鼠睾丸的形态学改变;酶联免疫分析法检测血清睾酮的变化。结果 衰老小鼠生精细胞减少，生精小管变细，血清睾酮含量明显降低;用药后，生精小管增粗，生精细胞增多，间质细胞增多，血清睾酮含量增加(P＜0.05)。延衰合剂高剂量组作用优于补肾益寿胶囊组及延衰合剂低中剂量组(P＜0.05)。结论 延衰合剂可以改善衰老小鼠睾丸的形态结构，抑制衰老小鼠血清睾酮含量的下降，具有一定的延缓衰老的作用。

延衰合剂;D-半乳糖;衰老小鼠;睾丸;血清睾酮

衰老是生物体在生命过程中形态、结构和功能逐渐衰退的综合现象。衰老过程所呈现的退行性变化主要表现为体内细胞数目减少，组织与器官萎缩，重量减轻，从而导致生物体的多种生理功能障碍。近年研究表明人体衰老与性腺结构和功能的退化密切相关〔1〕。人体衰老时睾丸形态结构发生退变，性激素水平降低已被证实。因此本实验采用D-半乳糖诱导建立亚急性衰老小鼠模型，应用光镜、电镜及酶联免疫分析法，观察延衰合剂对衰老小鼠睾丸形态结构及血清睾酮的影响，从形态及功能的层面探讨具有补肾填精、益气活血功效的中药复方延缓衰老的相关机制，为中医药延缓衰老提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 昆明种雄性小鼠60只，SPF级，由重庆医科大学动物中心提供，2～3月龄，体重(20±2)g，动物使用许可证:SCXK(渝)20070001。

1.1.2 药物与试剂 延衰合剂中药材由重庆医科大学附属第一医院中医科提供，制成含生药浓度2 g/ml的水煎剂，置4℃冰箱中保存备用。补肾益寿胶囊由太极集团重庆涪陵制药厂生产(批号:国药准字Z50020569)，规格为每粒0.3 g。根据人和小鼠的剂量转换用生理盐水配成18 g/kg的水溶剂，D-半乳糖(美国Amersco公司)用生理盐水配成6%的浓度，血清睾酮ELISA检测试剂盒(重庆升博科技有限公司)。

1.1.3 主要仪器 光学显微镜(日本OLYMPUS)，透射电子显微镜(Hitachi7500)，酶标仪(美国MD)低温高速离心机(德国sigma)，电子天平(岛津SHIMADZU)，显微图像分析仪(Leica CTR6000)隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)，4℃冰箱(新飞FRESTECH)以上仪器由重庆医科大学眼科实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模 将60只昆明雄性小鼠随机分为正常对照组、衰老模型组、补肾益寿胶囊组、延衰合剂低剂量组、延衰合剂中剂量组、延衰合剂高剂量组，每组10只。各组小鼠分笼在相同条件下喂养，自由进食饮水，除正常对照组每日颈背部皮下注射生理盐水0.04 ml外，其余各组小鼠均每日颈背部皮下注射等体积的D-半乳糖(120mg/kg)，每日1次，连续8 w，形成糖代谢紊乱所致的亚急性衰老模型。造模同时，正常对照组每日生理盐水0.4m l灌胃，补肾益寿胶囊组灌胃等体积的补肾益寿胶囊水溶剂，延衰合剂分别灌胃等体积的延衰合剂水煎剂(低剂量组9 g/kg，中剂量组18 g/kg，高剂量组36 g/kg)，每日1次，连续8 w。

1.2.2 取材 于末次给药后1 h称量各组小鼠体重，各组小鼠用10%水合氯醛(0.1 ml/kg)腹腔注射麻醉后摘眼球取血，并按光镜及电镜标本需要取下相应的睾丸称湿重后固定，最后颈椎脱臼致死。

1.2.3 观察指标及方法 ①一般情况:观察造模后各组小鼠体重、精神状态、毛发、活动力等情况。②血清睾酮检测:将取出的血液室温自然凝固20 min后3 000 r/min低温离心15 min分离血清，置4℃冰箱中保存，用ELISA方法测定样品睾酮含量，严格按照试剂盒说明书进行检测。③睾丸组织形态结构的观察:取双侧睾丸，一侧睾丸用4%多聚甲醛固定，常规组织切片，苏木素-伊红(HE)染色，制成光镜标本并拍照分析;另一侧睾丸活体白膜下固定后修取1mm3组织块置2.5%缓冲戊二醛中固定2 h，磷酸缓冲液冲洗后，1%四氧化锇(OSO4)固定1 h，逐级酒精、丙酮脱水，EPon812包埋，超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双染，透射电镜观察拍照。用图像分析系统对每组每只小鼠睾丸随机测量30个横切的生精小管直径。并计算30个由3个生精小管围成的三角区内的间质细胞数。在光镜及电镜下观察生精小管内生精细胞及睾丸间质的形态学变化。

2 结果

2.1 一般情况 衰老模型组小鼠与正常对照组比较体重减轻，精神差，活力下降，毛发无光泽，部分可见毛发脱落。补肾益寿胶囊组及延衰合剂各剂量组较模型组体重增加，精神状态好，活力强，毛发光泽，其中以延衰合剂高剂量组改善最明显。见表1。

2.2 各组小鼠血清睾酮含量的变化 补肾益寿胶囊组及实验组的血清睾酮水平较模型组均有升高。与正常对照组相比，衰老模型组血清睾酮含量明显降低(P＜0.05);与衰老模型组小鼠相比，用药后延衰合剂低、中、高剂量组及补肾益寿胶囊组均可明显抑制衰老小鼠血清睾酮含量的下降(P＜0.05)。延衰合剂高剂量组作用明显优于补肾益寿胶囊组及延衰合剂低、中剂量组(P＜0.05)。见表1。

2.3 各组小鼠睾丸生精小管形态结构及间质细胞的变化 与正常对照组相比，衰老模型小鼠生精小管直径变小，生精细胞层数变少，睾丸间质细胞数减少(P＜0.05);用药后补肾益寿胶囊组、延衰合剂低、中、高剂量组生精小管直径均变大(P＜0.05)，间质细胞增多(P＜0.05)。延衰合剂高剂量组的变化比延衰合剂低、中剂量组及补肾益寿胶囊组更明显(P＜0.05)。见表1。

2.4 光镜照片 正常对照组小鼠生精小管横切面可见生精小管界膜完整，基膜内各级生精细胞及支持细胞排列整齐，生精小管内各级生精细胞多在6～8层，管腔内可见大量成熟的精子，支持细胞轮廓不清，核常呈不规则型。睾丸间质细胞成群分布，圆形或多边形，核圆居中，可有1～2个核仁。衰老模型组小鼠生精小管形态结构发生明显变化:生精上皮变薄，生精细胞层数变少，排列疏松，间隙增大，各级生精细胞数量减少。补肾益寿胶囊组及延衰合剂各剂量组生精小管的形态结构得到不同程度的恢复，表现为生精上皮变厚，生精细胞层数增多最多达5～7层，精子细胞及成熟精子增多，间质细胞数量增多，其中补肾益寿胶囊组及延衰合剂高剂量组变化较延衰合剂低中剂量组明显。见图1。

2.5 电镜照片 正常对照组睾丸间质细胞核内染色质分布均匀，线粒体和滑面内质网丰富，可见管状嵴线粒体，线粒体无肿胀，有少量脂滴，显示出具有分泌类固醇激素细胞的形态特点，衰老模型组间质细胞线粒体数量减少，滑面内质网减少，溶酶体及脂滴明显增多，还可见髓样结构及空泡，补肾益寿胶囊组及延衰合剂各剂量组睾丸间质细胞线粒体数量明显多于衰老模型组，滑面内质网有所恢复，核内染色质分布较均匀，形态结构较衰老模型组有明显改善，延衰合剂高剂量组作用优于延衰合剂低、中剂量组及补肾益寿胶囊组。见图2。

表1 各组小鼠体重、生精小管直径、睾丸间质细胞数及血清睾酮比较(±s，n=10)

表1 各组小鼠体重、生精小管直径、睾丸间质细胞数及血清睾酮比较(±s，n=10)

与衰老模型组比较:1)P＜0.05;与延衰合剂高剂量组比较:2)P＜0.05

组别 体重 生精小管直径(μm) 睾丸间质细胞数(个) 血清睾酮(ng/dl)7.49正常对照组 49.39±2.731)2) 184.40 ±7.431)2) 304.80±10.001)2) 177.65±15.511)2)补肾益寿胶囊组 46.22±2.611) 157.30±7.391)2) 222.80±13.251)2) 148.36±5.921)2)延衰合剂低剂量组 42.92±3.551)2) 141.70±6.881)2) 199.70±14.671)2) 103.72±14.051)2)延衰合剂中剂量组 46.04±3.651)2) 149.90±8.931)2) 212.00±9.201)2) 130.30±10.581)2)延衰合剂高剂量组 48.51±3.201) 169.70±7.231) 237.30±13.681) 163.04±24.471)衰老模型组 39.84±3.91 134.20±5.92 169.70±9.26 66.13±1

图1 各组小鼠生精小管形态结构变化的光镜照片(HE，×400)

图2 各组小鼠睾丸间质细胞的形态结构电镜照片(×10 000，75 nm)

3 讨论

D-半乳糖所致衰老动物模型稳定可靠，造模方法简便易行，已成为国内公认的衰老动物模型，在抗衰老药物研究等领域得到广泛应用〔2〕。研究发现D-半乳糖可导致雄性大鼠原发性骨质疏松和血清睾酮含量降低以及睾丸结构发生改变。本实验采用此方法造模，形成糖代谢紊乱引起衰老。造模后衰老模型组一般情况与正常对照组相比体重明显下降、活力降低、精神差、可见明显毛发脱落，说明衰老模型建立成功，睾丸组织形态学改变与血清睾酮含量的明显下降进一步给予支持。

衰老时睾丸组织形态结构发生退变，睾丸间质细胞数量减少，超微结构改变，睾酮合成能力也明显下降。研究表明D-半乳糖所致衰老小鼠睾丸组织结构明显老化，出现精子生成能力减弱，血清睾酮水平降低〔3〕。目前，针对雄激素缺乏所引起的相关症状，临床上西医多采用性激素替代治疗〔4，5〕，睾酮治疗能提高体能、提高骨密度、增加脂质代谢、改善性功能等，但是外源性的雄激素补充治疗引起的红细胞增多、胰岛素抵抗、前列腺癌、阻塞性黄疸、抑制精子产生的不良反应日益引起人们的密切关注，特别是孙辉〔6〕等研究表明外源性雄激素能够抑制精子发生，从而影响了雄激素补充治疗的临床应用。

中医认为，肾为先天之本，肾虚是人体衰老的根本原因，而瘀血和痰浊是促进衰老的重要因素。肾虚衰老学说认为肾中精气由盛渐亏是导致机体组织结构、生理功能和代谢功能逐渐衰退的内在机制，补肾填精是延缓衰老的根本大法，但单纯滋阴填精，难以化成肾中精血，而且精血不生，反易成阴凝之邪伤伐元气。若纯使用壮阳之品，或获一时之效，但势必耗损精血，使虚损益甚。故必须采取补肾填精，助阳化气之法，同时加以活血化瘀化浊，使精生气，气生精，精气充足，瘀血化，痰浊除，气血运行通畅，从而推动脏腑功能，达到神聪形健，益寿延年的目的。

延衰合剂由刺五加、淫羊藿、熟地、制首乌、丹参、肉苁蓉等12味中药组成，具有补肾填精，益气活血等功效。适用于临床辨证属肾精亏虚、气虚血瘀等证型。现代研究表明刺五加具有神经元保护、免疫调节、抗氧化等作用，刺五加苷可以提高D-半乳糖致衰老模型大鼠血清白细胞介素(IL-2)，IL-6水平，增强T淋巴细胞增殖功能而延缓免疫衰老〔7〕。淫羊藿苷可以提高亚急性衰老雄性大鼠雄激素水平，减少生殖细胞凋亡，改善睾丸组织的退行性变化，抑制生殖细胞衰老基因P16蛋白表达延缓性腺衰老。淫羊藿总黄酮可以通过下调促炎性细胞因子表达和上调抗炎性细胞因子表达达到干预炎性衰老的目的〔8〕。熟地黄能改善D-半乳糖致衰老模型大鼠学习记忆能力，提高脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶(NOS)活性，减少丙二醛(MDA)、过氧化脂(LPO)含量，增强抗氧化能力，减缓脑细胞衰老的进程〔9〕。肉苁蓉麦角甾苷能够提高D-半乳糖衰老模型小鼠心脑组织端粒酶活性而延缓衰老〔10〕。延衰合剂中的其他中药不仅符合中医方药配伍理论，而且也可从多途径发挥整个方药的协同延衰作用。补肾益寿胶囊可以改善肾气虚患者的脂质过氧化状态和肾气虚症状〔11〕，具有确切的延缓衰老作用，因此本实验选择补肾益寿胶囊为阳性对照药。

1 Ponholzer A，Plas E，Schatzl G，etal.Association of DHEA-Sand estradiol serum levels to symptoms of agingmen〔J〕.Aging Male，2002;5(4):233-8.

2 朱亚珍，朱虹光.D-半乳糖致衰老动物模型的建立及其检测方法〔J〕.复旦学报(医学版)，2007;34(4):617-9.

3 齐亚灵，方艳秋，谭 岩，等.细辛、杜仲及其合剂对亚急性衰老小鼠睾丸及血清睾酮影响的实验研究〔J〕.中国老年学杂志，2007;27(23):2271-4.

4 Kalinchenko SIu，Vorslov LO，Aglamazian NL，etal.Efficacy and safety of hormonal therapy with androgens(androgel)in men with erectile dysfunction，partial androgen deficiency of agingmale and cardiovascular diseases〔J〕.Urologiia，2007;57(1):59-61.

5 Fabbri A，GiannettaE，Lenzi A，et al.Testosterone treatment tomimic hormone physiology in androgen replacement therapy.A view on testosterone gel and other preparations available〔J〕.Expert Opin Biol Ther，2007;7(7):1093-106.

6 孙 辉，王雪松.外源性睾酮抑制精子发生机制的研究〔J〕.中国医学创新，2010;7(9):35-6.

7 孟宪军，杨 平，张 丽.刺五加苷对D-半乳糖致衰老模型大鼠免疫功能的影响〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(2):216-8.

8 夏世金，沈自尹，俞卓伟，等.基于基因表达谱研究淫羊藿总黄酮干预老年大鼠海马炎性衰老的效果与机制〔J〕.实用老年医学，2010;24(1):24-7.

9 安红梅，史云峰，胡 兵，等.熟地黄对D-半乳糖衰老模型大鼠脑衰老的作用研究〔J〕.中药药理与临床，2008;24(3):59-60.

10 张洪泉，翁晓静，陈莉莉，等.管花肉苁蓉麦角甾苷对衰老小鼠端粒酶活性和免疫功能的影响〔J〕.中国药理学与毒理学杂志，2008;22(4):270-3.

11 曹文富，何 英，周国庆，等.补肾益寿胶囊对肾气虚证患者SOD、MDA、GSH-Px的影响〔J〕.中成药，2004;26(1):41-2.

Effect of yanshuaim ixture on testiculus and serum testosterone in subacute aging m ice caused by D-galactose

HUANG He-Xian，CAO Wen-Fu，PENG Shuang，et al.
Department of Integrated Traditional Chinese M edicine and Western Medicine，the First Affiliated Hospital of Chongqing M edical University，Chongqing 400016，China

Objective To study the effect of yanshuaimixture on testiculus and serum testosterone in subacute agingmice.M ethods Themale Kunmingmice were selected to build agingmicemodel by D-galactose.The changes in morphology of testiculus were observed by lightmicroscope and electronmicroscopy after treated with yanshuaimixture.The changes of serum testosteronewere determined by ELISA.Results The spermatogenic cellswere reduced，seminiferous tubulewere thinned and serum testosterone levelwas decreased in agingmice，there was significant difference between model and normal control groups(P ＜0.05).After treatment，the testicles weight were increased，seminiferous tubulewere thickened and the number of spermatogenic cells and stromal cellswere increased，the serum testosterone contentwere increased(P＜0.05).The effect of yanshuaimixture hight-dose group were better than that of Bushenyishou capsules，yanshuaimixture low-dose and middle-dose groups(P＜0.05).Conclusions Yanshuaimixture could improve themorphology of testiculus in agingmice and could inhibit the decrease of serum testosterone of agingmice，which have postponing ageing role inmice.

Yanshuaimixture;D-galactose;Agingmice;Testiculus;Serum testosterone

R285.5

A

1005-9202(2011)12-2239-04

曹文富 (1962-)，男，教授，博士，硕士生导师，主要从事中西医结合肾病及内分泌代谢病研究与中药新药研发。

黄和贤(1984-)，男，在读硕士，主要从事中西医结合内分泌代谢病及肾病研究。

〔2010-07-05收稿 2010-09-27修回〕

(编辑 袁左鸣/曹梦园)