中药解毒通络保肾散对实验性糖尿病大鼠肾脏基质金属蛋白酶2 mRNA表达的影响

何 泽 南 征 李 才 陈 曦 高 蕾 孙胜君

(长春中医药大学附属医院糖尿病科，吉林 长春 130021)

中药解毒通络保肾散对实验性糖尿病大鼠肾脏基质金属蛋白酶2 mRNA表达的影响

何 泽 南 征1李 才2陈 曦 高 蕾3孙胜君

(长春中医药大学附属医院糖尿病科，吉林 长春 130021)

目的 探讨中药解毒通络保肾散(JDTLBSS)对实验性糖尿病(DM)大鼠肾脏组织基质金属蛋白酶2(MMP-2)mRNA表达的影响。方法 采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，检测分别灌服JDTLBSS、氨基胍(AG)药物8 w的链脲佐菌素(STZ)致DM大鼠肾脏内MMP-2 mRNA及TIMP-2 mRNA表达。结果 在DM状态下，大鼠肾脏MMP-2 mRNA呈低表达状态，TIMP-2 mRNA呈高表达状态，MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA降低;与DM组比，JDTLBSS组和AG组均有提高DM大鼠MMP-2 mRNA表达，抑制TIMP-2 mRNA表达，升高MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA作用，二者作用相当。结论 JDTLBSS对DM大鼠肾脏功能和结构的保护作用机制之一可能与其上调MMP-2 mRNA表达，下调TIMP-2 mRNA表达作用，提高MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值，从而促进肾小球细胞外基质(ECM)的降解有关。

糖尿病肾病;解毒通络保肾散;实验研究;基质金属蛋白酶2;组织型基质金属蛋白酶抑制物

糖尿病肾病(DN)的发生发展是多因素综合作用的结果，肾小球基底膜增厚和以肾小球系膜区为主的细胞外基质(ECM)积聚是DN的基本病理特点。ECM积聚是基质合成和降解之间失去平衡的结果。基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织型基质金属蛋白酶抑制物(TIMPs)在ECM降解中起重要作用。本文前期研究表明，中药复方解毒通络保肾散(JDTLBSS)能够改善实验性DM大鼠一般状况，调节糖脂代谢，抑制DM大鼠肾脏肥大及高滤过，减少尿蛋白的排出，保护肾小球结构和功能〔1〕;能够抑制晚期糖基化终末产物形成，减少其介导的肾组织损伤〔2〕。本实验从分子水平观察该中药复方对链脲佐菌素(STZ)致DM大鼠肾脏ECM降解机制的影响，以探讨JDTLBSS的深层次疗效作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性Wistar大鼠55只，体重170～200 g，由吉林省实验动物中心提供。饲料为常规大鼠饲料。实验期间大鼠自由摄食和饮水，适应性喂养1 w，取尿糖、尿蛋白阴性的健康状况良好的动物为实验对象。

1.2 主要试剂和药品 JDTLBSS(长春中医药大学附属医院制剂中心);氨基胍(AG)和STZ(Sigma);逆转录酶(AMV)、Oliga Dt引物、RNA酶抑制剂(Rnasin)、四种 dNTP混合液(10 mmol/L)(Promega);TaqDNA聚合酶/10×Taq酶缓冲液、10×PCR缓冲液(上海生工生物工程公司);异硫氰酸胍(Promega);焦碳酸二乙酯(DEPC)、十二烷基肌氨酸钠、溴化乙锭(Sigma);DNA 标尺，DL-2000(Takara)。

1.3 主要设备 医用离心机(北京);PCR仪(Ferotec，杭州大和)，台式冷冻离心机(Hesmal，德国)，电泳仪(Mini-gel，日本)，电泳槽、恒温水域箱、紫外分光光度计，紫外检测仪(手提式紫外灯)，凝胶图像处理系统(Tamon GIS-1000，上海)。

1.4 实验动物模型的复制与分组 动物禁食12 h，按体重随机分为2组，即正常对照组(CN，n=10)，DM模型复制组45只。DM大鼠模型复制:用50 mg/kg STZ(临用前用0.1 mol/L柠檬酸缓冲液溶解，pH4.3)单次腹腔注射。另一组仅腹腔注射上述等体积缓冲液作为对照组。注射STZ 3 d后测尿糖和血糖，尿糖+++以上，血糖水平不低于16.7 mmol/L，尿量和饮水量明显增多者，列入DM观察对象，共36只。将其分为三组:①DM组(DM，n=12)，②JDTLBSS处理的 DM 组(DM+J，n=12)，③AG处理的DM 组(DM+A，n=12)。DM+J组每日上午灌服JDTLBSS浓缩液2 g/kg，DM+A组每日上午灌服AG 40 mg/kg，DM组灌胃等体积水。

1.5 肾脏标本及肾组织匀浆制备 所有实验动物自由进食和饮水，大鼠单笼饲养，每3天量体重，并观察一般状态。8 w末实验结束，处死动物，快速切除肾脏，滤纸吸干，去掉包膜，用精密天平即刻称重。取正常组、DM组、DM+A组、DM+J组的大鼠肾脏组织，用生理盐水冲洗，剪取肾组织后称重，按1∶9浓度(W∶V=1 g∶9 m l)加入匀浆介质，用电动玻璃匀浆器在4℃条件下制备组织匀浆。3 000 r/min离心20 min，吸取上清液保存于－70℃冰箱。

1.6 PCR引物 由上海生工生物工程公司提供(美国PE公司391型DNA自动合成仪合成)。MMP-2正义链引物5'-TGG GCA ACA AAT ATG AGA GC-3';反义链引物5'-CGG CATCCA GGT TATCGGGG-3';MMP-2扩增产物全长791 bp。TIMP-2正义链引物5'-GTG GAC TCTGAG AACGAC AT-3';反义链引物5'-CCA GGA AGG GATGTC AGA GC-3';TIMP-2扩增产物全长583 bp。β-actin正义链引物5'-GCC CAG AGC AAG AGA GGC AT-3';反义链引物 5'-GGC CAT CTC TTG CTC GAA GT-3';β-actin扩增产物全长513 bp。

1.7 肾脏组织 MMP-2 mRNA、TIMP-2 mRNA表达含量及MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值检测 采用RT-PCR方法测定。结果分析利用天能凝胶成像处理系统内部软件对每一样品PCR产物扩增的特异性片段(MMP-2、TIMP-2和β-actin)进行密度扫描，以β-actin密度作为参考定量标准，分别计算MMP-2、TIMP-2和β-actin密度比值作为定量结果。

1.8 统计学分析 应用SPSS13.0统计软件进行分析，数据以±s表示，均数差异显著性用方差分析检验。

2 结果

与CN组相比，DM组MMP-2 mRNA呈低表达状态(P＜0.01)，TIMP-2 mRNA呈高表达状态(P＜0.01)，MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA变小;DM+A组、DM+J组MMP-2 mRNA呈高表达状态(P＜0.01)，TIMP-2 mRNA呈低表达状态(P＜0.01)，MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值变大(P＜0.01)。与DM组比较，DM+A组、DM+J组MMP-2 mRNA呈高表达状态(P＜0.01)，TIMP-2 mRNA呈低表达状态(P＜0.01)，MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值变大(P＜0.01)。与DM+A组比较，DM+J组MMP-2 mRNA及TIMP-2 mRNA均无显著差异(P＞0.05)。见表1、图1、图2。

表1 大鼠肾脏MMP-2 m RNA、TIMP-2 m RNA相对值及MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值比较(±s)

表1 大鼠肾脏MMP-2 m RNA、TIMP-2 m RNA相对值及MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值比较(±s)

与CN组比较:1)P＜0.01;与DM组比较:2)P＜0.01

组别 n MMP-2 mRNA TIMP-2 mRNA MMP-2 mRNA/10 0.70±0.05 0.69±0.03 1.03±0.05 DM组 9 0.49±0.071) 0.78±0.061) 0.77±0.081)DM+A组10 0.81±0.051)2) 0.51±0.071)2) 1.60±0.091)2)DM+J组 10 0.82±0.031)2) 0.48±0.021)2) 1.69±0.041)2)TIMP-2 mRNA CN组

图1 各组大鼠MMP-2 m RNA/β-actin表达半定量分析

图2 各组大鼠TIMP-2 m RNA/β-actin表达半定量分析

3 讨论

合成增加和降解减慢二者共同作用使ECM积聚，从而导致肾小球结构和功能变化，最终导致肾小球硬化。MMPs系统是一类依赖金属离子锌并以ECM成分为水解底物的蛋白水解酶，是ECM的主要降解酶系统，MMPs活性受其抑制物TIMPs的调节，两者的活性及它们之间的协调作用也是决定ECM降解的重要环节〔3〕。在肾小球和系膜细胞，MMP-2占优势，其主要抑制物为TIMP-2〔4〕。MMP-2主要水解底物是变性胶原及基底膜的主要成分Ⅳ型胶原和Ⅴ型胶原等，但对间质胶原无作用。MMP-2可以分解纤维黏连蛋白和层黏连蛋白。可见MMP-2为肾小球ECM主要降解酶，与DN肾脏病变的关系密切。如何选择有效的药物改善和纠正肾小球ECM积聚是当前DN防治中急需解决的问题。

有关中医药对MMPs的调节作用较少报道。研究结果表明，与正常对照组大鼠比较，STZ诱发的DM大鼠肾皮质MMP-2 mRNA表达减少，TIMP-2 mRNA表达上调，MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值明显下降，提示在DM情况下，肾小球ECM降解程度降低〔5〕。本实验结果显示在DM状态下，大鼠肾脏MMP-2 mRNA呈低表达状态，而TIMP-2 mRNA呈高表达状态，MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA降低;JDTLBSS对DM大鼠肾脏功能和结构的保护作用机制之一可能与其上调MMP-2 mRNA表达，下调 TIMP-2 mRNA表达，提高 MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值，促进肾小球ECM的降解有关。

JDTLBSS作为临床治疗DN有效处方，不仅能保护肾功能，抑制蛋白非酶糖化，而且对ECM降解酶MMP-2有一定的调节作用，这为临床上应用中药复方防治肾小球硬化提供了新的实验基础，也一定程度上为寻找中药防治肾小球硬化提供了新的研究思路。JDTLBSS对DM大鼠肾脏功能和结构的保护作用机制之一可能与其上调 MMP-2 mRNA表达，下调 TIMP-2 mRNA表达作用，提高MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值，从而促进肾小球ECM的降解有关，由于条件限制，本研究样本数少，时间短，有待进一步深入研究。

1 何 泽，南 征.解毒通络保肾散对实验性糖尿病大鼠肾脏功能和结构的影响〔J〕.中国实用医药，2009;4(20):159-60.

2 何 泽，南 征，李 才.解毒通络保肾散对晚期糖基化终末产物肾毒性影响的实验研究〔J〕.长春中医药大学学报，2009;25(4):480-2.

3 Rankin CA，Suzuki K，Itoh Y，et al.Matrixmetalloproteinases and TIMPs in cultured C57BL/6J-cpk kidney tubules〔J〕.Kidney Int，1996;50(3):835-44.

4 Strongin AY，Collier I，Bannikov G，etal.Mechanism of cell surface activation of 72-KDa type Ⅳ collagenase，isolation of the activated from of the membranemetalloproteinase〔J〕.JBiol Chem，1995;270(10):5331-8.

5 于晓艳，李 才，何 泽，等.糖基化终末产物对大鼠肾皮质基质金属蛋白酶2活性和表达的影响〔J〕.中华内分泌代谢杂志，2003;19(5):402-5.

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1005-9202(2011)12-2231-03

1 长春中医药大学附属医院中医研究所

2 吉林大学再生医学研究所 3 长春中医药大学附属医院肝脾胃病科第一作者:何 泽(1969-)，男，博士，副主任医师，副教授，硕士生导师，主要从事中医治疗糖尿病及其并发症的研究。

〔2010-10-12收稿 2011-02-12修回〕

(编辑 袁左鸣/曹梦园)