WIP1对小鼠B细胞及T细胞发育的影响

陈陟阳，张俊伶，马小茗，易微微，陈显达，石桂英，鞠振宇

（中国医学科学院，北京协和医学院，医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021）

W IP1（wild-type p53-induced phosphatase）是一种核蛋白，为丝氨酸/苏氨酸特异蛋白磷酸酶2C型家族（serine/threonine specific protein phosphatase type 2C，PP2C）中的一员，由 PPM1D （protein phosphatase magnesium-dependent 1 delta）基因编码，介导众多DNA损伤应急信号通路［1］。W IP1表达非常广泛，通过 RT-PCR证实在小鼠胚胎和成体几乎各个脏器组织均有 W IP1 mRNA的表达，包括乳腺、子宫、卵巢、肾上腺、皮肤、肝脏和睾丸等组织均检测到该基因的表达，特别在睾丸中表达量明显增高。缺失WIP1的小鼠能够正常生产，但是却显示出一系列的产后缺陷，主要体现在雄性小鼠发育不全，生殖器官萎缩，W IP1-/-雄性小鼠的睾丸发育不全，生育力下降及生命期限缩短。缺失 WIP1小鼠表现出对病原体易感性增强［2］。WIP1基因在许多人类癌症，特别是乳腺癌中过表达，而敲除PPM1D基因的小鼠能够抵抗乳腺癌的发生，暗示W IP1可能是一个致癌基因［3，4］。在 APCmin肠癌小鼠模型中，W IP1基因缺失通过促进小肠干细胞的凋亡，调控小肠干细胞稳态，有效抑制肿瘤生成［5］。在小鼠胸腺发育中，由于W IP1基因缺失导致 P53的持续激活，致使T细胞发育障碍［6］。.在神经系统中，WIP1通过P53依赖途径调控神经干祖细胞的自我更新［7］。此外在对衰老的研究中WIP1基因同样引起关注，伴随着衰老的进行W IP1基因的表达降低，导致胰岛 β细胞自我更新及增值能力下降［8］。综合前期结果提示，W IP1基因参与细胞增殖、凋亡等众多信号通路，对DNA损伤修复［9］、癌症的发生、细胞稳态的调控［10］及抗衰老起重要的作用。然而，目前还没有研究报道过W IP1基因对骨髓B细胞发育的影响。为了研究W IP1基因是否直接参与调控成年小鼠B细胞及T细胞的发育，我们利用基因敲除小鼠及流式细胞术为工具研究W IP1基因对成年小鼠B细胞及T细胞发育的影响。

1 材料和方法

1.1 PCR方法鉴定W IP1－/－小鼠基因型

小鼠在出生10 d用剪趾法标记，收集剪下的组织，裂解组织提取基因组DNA，PCR鉴定基因型，反应条件：94℃预变性3 min；变性94℃ 30 s，退火61℃30 s，延伸72℃ 30 s，40个循环；72℃延伸10 min。鉴定 引 物 为 Wip1 WT primer1： 5＇-GACAGTCCTGTGCCAAAATGCT-3＇；Wip1 WT primer2：5＇-GGTGACTTGATTGGTGGTGTAGA-3＇；Wip1 KO primer A： 5＇-GCAGGGCTGTTTGTGGTGCT-3＇；Wip1 KO primer B：5＇-GCATGCTCCAGACTGCCTT-3＇，W IP1 -/-产物长度176 bp，WT产物长度236 bp，PCR试剂购自上海生工生物技术有限公司，中国（图1）。

1.2 流式细胞术分析

1.2.1 骨髓单细胞悬液制备：实验使用成年3月龄129小鼠，颈椎脱臼牺牲小鼠，取双腿胫骨、股骨用预冷的PBS冲出骨髓腔的骨髓细胞，吹打成单细胞悬液，过滤、计数，调整浓度至1×108cell/m L。本实验使用小鼠均来自北京协和医学院比较医学中心，动物生产许可证号：SCXK（京）2009-0007，动物使用许可证号：SYXK（京）2005-0001。

1.2.2 骨髓B细胞及粒细胞染色方案 取10 uL全骨髓细胞悬液置于96孔板一孔中，加入 B220/ PE-cy7（Biolegend）、CD11b/APC-cy7（Biolegend）抗体，冰上避光孵育 30 min，加入 200 uL staining medium（PBS+1％BSA），400 g/m in，离心5 m in，弃上清后用200 uLstaining medium重新悬浮细胞，200目滤网过滤至流式管中准备流式分析，每只小鼠收集1 ×105细胞，计算 B220/PE-cy7阳性细胞及CD11b-APC-cy7阳性细胞所占的比例。

1.2.3 骨髓B细胞发育染色方案 取10 uL全骨髓细胞悬液至于 96孔板一孔中，加入 IgD/FITC （Biolegend）、CD43/Percp-cy5.5（Biolegend）、B220/ PE-cy7（Biolegend）、IgM/APC（Biolegend）抗体，冰上避光孵育30 min，加入200 uL staining medium（PBS +1％BSA），400 g/m in离心 5 m in，弃上清后用200 uL staining medium重新悬浮细胞，200目滤网过滤至流式管中准备流式分析，每只小鼠收集1× 105细胞，计算B220+CD43-IgM-IgD-（Pre-B）；B220+CD43-IgM+IgD-（immature-B）；B220+CD43-IgM+IgD+（mature-B）细胞所占的比例。

1.2.4 胸腺单细胞悬液制备 颈椎脱臼牺牲小鼠，完整摘取胸腺，使用两片载玻片研磨，200目滤网过滤置离心管中，计数、调整浓度至 1×108cell/m L。取10 uL细胞悬液置于96孔板一孔中，加入CD8/ FITC、CD45/Percp-cy5.5、CD4/APC-cy7抗体，冰上避光孵育30 min，加入200 uLstaining medium（PBS +1％BSA），400 g/m in离心5 m in，弃上清后用200 uLstaining medium重新悬浮细胞，200目滤网过滤至流式管中准备流式分析，每只小鼠收集1×105细胞，计算 CD45阳性细胞、CD8单阳性细胞、CD4/ CD8双阳细胞、CD4/CD8双阴性细胞及 CD4单阳性细胞所占的比例。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 PCR鉴定结果及 W IP1基因缺失小鼠形态差异

图1 PCR鉴定WIP1基因敲除小鼠的凝胶电泳分析及W IP1缺失小鼠形态差异图1A：Marker为DL2000 marker，H20为空白对照，WT为野生型对照，KO为基因敲除对照，HET为杂合对照； 1316/1317/1318/1319为样品；1B为3月龄W IP1缺失雄性小鼠与同窝野生型对照体型对比Fig.1 PCR genotyping of the W IP1-/-mice and the Morphological alterations in Wip1 nullmales 1A：The marker is the DNA molecular weightmarker；H2O indicates the negative control；WT：wild-type control； KO：WIP1 gene knockout control；HET：heterozygosity control；Lane 1316—1319：stands for DNA samples of W IP1 mice；1B：The smaller animal on the right is W IP1-/-male littermate along with a wild-type male littermate at 3 months of age

基因型鉴定结果如图1A所示。W IP1基因在小鼠全身众多脏器组织中表达，由于W IP1基因在睾丸中表达最为明显，因此该基因缺失致使雄性小鼠发育不全，生育力下降，雄性缺失小鼠在3月龄时体型较同窝野生型对照小鼠明显变小（如图1B）。有研究报道W IP1缺失的雄性小鼠生命期限明显缩短，而W IP1+/-雄性小鼠及W IP1-/-雌性小鼠生命期限较野生型差异不明显。

2.2 骨髓中B细胞比例流式分析

为研究W IP1基因缺失对成年小鼠骨髓B细胞发育的影响，我们分析了3月龄W IP1-/-小鼠和野生型对照小鼠的骨髓B细胞和M细胞的比例。（如图2A 2B）。结果显示W IP1缺失的小鼠骨髓B细胞比例下降（如图2C）。而M细胞比例无明显差异。为了进一步研究B细胞在发育过程中哪一阶段出现问题，我们依据骨髓B细胞发育过程中特异性表面标记的表达顺序进行了染色（如图2D 2E 2F 2G），结果显示 W IP1基因缺失的骨髓 B细胞各发育阶段比较野生对照均为正常，提示骨髓B细胞比例下降可能是由于Pre-B之前更前体的祖细胞发育障碍导致。

2.3 胸腺中T细胞比例流式分析

为研究W IP1基因对成年小鼠胸腺发育的影响，我们分析了三月龄W IP1-/-及野生型对照小鼠的胸腺形态差异（如图3D），发现WIP1缺失小鼠的胸腺明显较野生型对照小，进一步对胸腺白细胞表面标记CD45染色发现，W IP1缺失小鼠胸腺白细胞比例明显较野生型低（如图3A、3B及3C）。

为进一步明确胸腺T细胞在发育阶段哪一步出现问题，我们对胸腺细胞进行CD8及CD4染色。结果显示，W IP1缺失小鼠胸腺CD8/CD4双阴性细胞比例明显升高，而CD8/CD4双阳性比例降低，由CD8/CD4双阳性细胞进一步分化的CD8单阳性细胞比例升高，而CD4单阳性细胞变化不大。

3 讨论

图2 骨髓B细胞比例流式分析2A：野生型小鼠骨髓中B细胞、M细胞比例；2B：WIP1敲除小鼠骨髓中B细胞、M细胞比例；2C：WIP1缺失骨髓B细胞比例与野生型对照比较明显降低；2D-2E：野生型骨髓B细胞发育流式图；2F-2G：WIP1缺失小鼠骨髓B细胞发育流式图Fig.2 Flow cytometric analysis of the proportion of B cell in bonemarrow2A：The ratio of B cells and M cells in wild-type mice bone marrow；2B：The ratio of B cells and M cells in WIP1-/-mice bonemarrow；2C：Histogram showing the lower percentage of B cells in W IP1-/-mice than WTmice；2D-2E：FACS plots show the development of B cell in WT bone marrow； 2F-2G：FACS plots show the development of B cell in W IP1-/-bone marrow

已有的研究表明W IP1蛋白作为一种磷酸酶，参与众多细胞信号通路调控，对DNA损伤修复、癌症的发生、细胞稳态的调控及抗衰老起重要的作用。而鲜有研究W IP1在B细胞T细胞发育过程中是否起到重要作用。我们对W IP1缺失小鼠的骨髓B细胞及胸腺 T细胞进行流式细胞术分析，发现WIP1缺失导致骨髓 B细胞比例降低，在胸腺中 T细胞发育障碍。骨髓和胸腺分别是B细胞和T细胞分化发育成熟的场所。在成熟小鼠的骨髓中，B细胞所占比例为20～30％左右，而W IP1缺失小鼠的骨髓B细胞仅为10％左右，为了弄清楚B细胞在发育过程的哪一阶段遇到障碍，我们进而依据B细胞发育阶段所表达的特异性表面标记进行染色，流式分析发现，在Pre-B之后的B细胞发育各阶段细胞比例均正常，从而猜想骨髓中B细胞比例整体降低可能是由于更前体的祖细胞发育障碍。W IP1缺失小鼠的胸腺中T细胞数目整体降低，在WIP1敲除小鼠模型中，CD8/CD4双阴性T细胞比例高于野生型对照小鼠，而CD8/CD4双阳性细胞比例低于对照组（差异不显著，但具有统计学差异），与已有报道一致，而CD8单阳性T细胞比例升高，不同于已有报道的CD8单阳T细胞比例降低，此外CD4单阳T细胞比例变化不明显而非已有报道的CD4单阳T细胞比例降低。

已有的报道发现衰老小鼠会产生淋系发育障碍，同时伴随着髓系细胞过度增殖［11］，这与人类衰老时免疫能力下降及髓系白血病发病率升高相吻合。我们的研究表明W IP1基因参与调控B细胞及T细胞的发育，W IP1基因缺失导致骨髓B细胞及胸腺T细胞比例下降，影响小鼠免疫系统正常发育，暗示W IP1基因可能直接参与调控个体衰老。作为重要的衰老相关调控基因，P53、P38等在衰老过程中发生明显变化，端粒缩短导致的复制性衰老直接引起P53的高表达；在小鼠胰岛β细胞中随着衰老的进行，WIP1表达逐渐下降，同时 P38表达升高［8］。而W IP1做为P38/P53信号通路的负反馈调节基因［1］，W IP1的缺失直接导致 p38/p53的升高，尤其在放射线照射、衰老等应激条件下，p38/p53持续的高表达使受损伤的细胞在修复之后无法正常的返回细胞周期，从而走向衰老或凋亡。可见W IP1对抗衰老尤其是调节免疫衰老具有重要的应用前景，然而W IP1的过表达极易导致癌症的发生，因此如何调控W IP1在衰老进程中的表达仍是限制其临床应用的重要障碍，对W IP1调控B细胞T细胞的具体分子机制及调控免疫衰老的机制仍须进一步研究。

图3 胸腺形态学分析注：3A：野生型小鼠胸腺白细胞比例；3B：W IP1缺失小鼠胸腺白细胞比例；3C：W IP1缺失小鼠胸腺白细胞比例较野生型对照组明显低；3D：野生型小鼠胸腺与W IP1缺失小鼠胸腺形态比较Fig.3 Morphological alteration about thymus in W IP1-/-nullmiceNote：3A：The ratio of white blood cells in 3 months old wild-type mice thymus；3B：The ratio of white blood cells in 3 months old W IP1deletion mice thymus；3C：Histogram showing the lower percentage of white blood cells in WIP1-/-mice compare with WTmice；3D：Thesize of W IP1-/-mice thymus is much smaller than WT

图4 胸腺T细胞流式分析4A：WIP1缺失小鼠胸腺CD8单阳性T细胞比例较野生型高；4B：W IP1缺失小鼠胸腺CD8/CD4双阴性T细胞比例较野生型明显高；4C：WIP1缺失小鼠胸腺CD8CD4双阳性T细胞比例较野生型低；4D：W IP1缺失小鼠胸腺CD4单阳性T细胞比例与野生型相比无明显差异；4E：野生型小鼠胸腺T细胞各亚群比例；4F：WIP1缺失小鼠胸腺T细胞亚群比例Fig.4 Flow cytometric analysis of the proportion of T cell in thymus 4A：The ratio of CD8 single positive cells in WIP1 deletion mice is higher than WT；4B： The ratio of CD8/CD4 double negative cells in W IP1 deletion mice is significantly higher than WT；4C：The ratio of CD8/CD4 double positive cells in W IP1 deletion mice is lower than WT；4D：The ratio of CD4 single positive cells do not have different between WIP-/-and WT；4E-4F：FACS plots of different subsets T cells from WT and WIP1-/-m ice thymus

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