季节性流感病毒H1N1实时荧光定量PCR检测方法的建立

许黎黎，鲍琳琳，秦 川

（中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021）

流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其流行特点是传播迅速，波及范围广。迄今为止，流感病毒已引起四次世界流感大流行，给人类社会的经济及健康造成了巨大损失［1］。

流感病毒属于正黏病毒科，其基因组为分节段负链RNA，根据病毒核衣壳蛋白（NP）和基质蛋白（M）不同可分为甲、乙、丙三种型别，均可感染人。甲、乙型流感病毒是人群中主要的流行病毒，甲型流感病毒根据病毒表面血凝素抗原的不同分为16个HA亚型；根据神经氨酸酶抗原的不同分为9个NA亚型［2］。甲型流感病毒中的 H1N1亚型曾经在1918年引起世界流感的大流行，自 1997年以后，H1N1亚型与 H3N2亚型交替在人群中流行。从2002开始我国的流感一直由H3N2占优势，持续了近3年后，2005年的9月以后H1N1亚型流感毒株重新成为我国的流感流行的优势毒株［3，4］，已对人类的健康及社会经济造成极大的威胁。因此，研究快速、敏感、特异的实验室诊断技术是早期发现病人，掌握传播途径和制定预防措施的根本。

目前国内诊断流感病毒的主要方法包含病毒分离和血清学诊断反应等，但这些方法费时费力，不宜于疾病初期的快速诊断与筛查，而核酸检测灵敏度高、快速、特异等优势决定了其在临床检测中的重要地位，传统的聚合酶链式反应（PCR）不仅无法对样本中的病毒进行定量检测，而且扩增反应后需要电泳检测，这不仅不适于大批量样本的筛选，而且容易因操作污染造成假阳性。近年发展起来的实时荧光定量 PCR（Real-time quantitative PCR）是一种在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号的积累实时检测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，不仅具有敏感性高、特异性强、重复性好等优点，而且通过分析软件对数据进行分析整理，结果更为准确直观，并有效地减少了假阳性发生的机会，已成为病原体检测的重要方法。

SYBR GreenⅠ是一种非探针型荧光染料，可以与双链DNA非特异性结合而发出荧光，由于其相对探针型染料价格低廉，因此已被广泛应用于不同病原体的实时荧光定量检测实验中。从目前的文献查询结果得知，尚未有基于SYBR GreenⅠ染料法的季节性流感病毒H1N1的实时荧光定量PCR检测方法的报道。本实验中，我们建立了一种可以快速定量检测季节性流感病毒H1N1的方法，灵敏度高，可用作基础及临床实验室对季节性流感病毒H1N1感染的辅助诊断方法和临床效果的监测手段。

1 材料和方法

1.1 材料

季节性流感病毒H1N1分离株A/Brisbane/59/ 2007由香港大学陈鸿霖教授提供，MDCK细胞由本所保存，按常规方法传代培养。RNA提取试剂盒RNeasy Mini Kit购自 QIAGEN公司，逆转录试剂盒SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis System 购自Invitrogen公司，荧光染料 Power SYBR Green PCR Master M ix，48孔0.2 m L PCR反应管 Fast Optical 48-well RXN Plate，及光学反应盖膜48-Well Optical Adhesive Film 25PK均购自ABI公司，实时荧光定量PCR仪为ABI公司StepOne系列产品。

1.2 方法

1.2.1 特异性引物的设计与合成：

选择季节性流感病毒H1N1的保守基因NP基因作为检测靶目标，首先从GenBank数据库中下载季节性流感病毒H1N1、H3N2、高致病性禽流感病毒H5N1、2009年新型甲型H1N1病毒等代表株的NP基因全序列，使用Clustal W软件进行序列同源性比对分析，筛选出季节性流感病毒H1N1特异性的保守序列作为引物候选区域。

应用Primer Express及Primer Prem ier 5.0软件包对候选引物进行进一步配对及筛选，得到最优特异性检测引物。引物设计及挑选遵循下列原则：①选用的引物位于季节性流感病毒H1N1 NP基因的保守区，与新型H1N1、H3N2、H5N1等其他亚型无交叉反应；②引物长度为18～25个碱基；③引物的GC％要求在40％～60％，理论Tm＞50℃；④引物自身之间尽可能避免碱基配对；⑤扩增的目的片段长度介于100～500 bp之间。

1.1.2 检测标准品的制备

24孔细胞培养板培养的 MDCK细胞接种 A/ Brisbane/59/2007毒株48 h后，取100μL细胞培养上清，按照RNeasy Mini Kit说明书提取病毒RNA，溶于30μL RNase-free H2O中。

取8μL病毒 RNA，按照 SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis System说明书合成第一链cDNA。

基于NP基因5’及3’端序列设计并合成PCR引物，由病毒全长 cDNA扩增出 NP基因。琼脂糖凝胶电泳检测NP基因的扩增情况，并对目的条带进行切胶回收及纯化。

用紫外分光光度计对回收后的NP全长基因进行核酸浓度测定，并换算成拷贝数。

1.1.3 实时荧光定量PCR标准曲线的建立

将计算好拷贝数的标准品做10倍梯度稀释，从1×1010copies/μL稀释至1×102copies/μL，共9个梯度。

配置 real-time PCR Mix，按顺序依次加入： SYBR Green PCR Master Mix（2×）10μL；5μM正反向引物各1μL；RNase-free H2O 6μL。将混合液均分至48孔0.2 m L PCR反应管 Fast Optical 48-well RXN Plate中，每管各加不同浓度标准品2μL，贴上光学反应盖膜 48-Well Optical Adhesive Film 25PK。打开 ABI STEPONE PCR仪及电脑，运行real-time PCR主程序。将48孔反应板放置在PCR仪上，开始以下 PCR程序：94℃预变性3 m in；94℃30 s，55℃30 s，72℃ 30 s，重复35次，每个循环结束后收集荧光信号。熔解曲线从 60℃至 95℃，每0.3℃读取一次吸光值。

1.1.4 重复性测试

每个梯度样品均平行设三个重复样，PCR重复三次，最终通过 MicroOffice Excel软件计算循环阈值（Ct）的平均值、标准差（SD）及变异系数（CV）。

2 结果

2.1 季节性流感病毒H1N1的特异性引物的设计

经序列同源性比对分析，筛选出季节性流感病毒H1N1特异性的保守序列作为引物候选区域后，再依据引物设计及挑选基本原则，本实验最终采用的特异性检测引物序列如下：SF-F（1141-1160）：5’-ctgagaagcagatactgggc-3’，SF-R（1460-1480）：5’-ctgcattgtctccgaagaaat-3’。扩增目的片段长度为340 bp，退火温度55℃。

2.2 季节性流感病毒H1N1N基因标准品的制备

基于NP基因5’及3’端序列设计并合成PCR引物，由 A/Brisbane/59/2007毒株全长 cDNA扩增出NP基因，琼脂糖凝胶电泳检测NP基因的扩增情况，结果如图1所示。对目的条带（1497 bp）进行切胶回收及纯化后，用紫外分光光度计对回收后的NP全长基因进行核酸浓度测定，依据公式计算出拷贝数。

2.3 扩增曲线、标准曲线、熔解曲线的建立及灵敏度和特异性评估

图1 季节性流感病毒H1N1全长N基因的PCR扩增及检测Fig.1 PCR amplification and detection of full length N gene of seasonal influenza H1N1 virus

将标准品做10倍梯度稀释，从1×1010copies/ μL稀释至1×102copies/μL，共9个梯度。标准品的扩增曲线如图2所示，标准曲线如图3所示，其中不同梯度标准品间线性关系（R2）达0.999，斜率介于-3.0至 -3.5之间，为 -0.3433，扩增效率为95.572％，亦位于标准扩增效率范围内。熔解曲线

图2 实时荧光定量PCR检测季节性流感病毒H1N1的扩增曲线Fig.2 Amplification curve of real-time PCR for seasonal influenza H1N1 virus detection

图3 实时荧光定量PCR检测季节性流感病毒H1N1的标准曲线Fig.3 Standard curve of real-time PCR for seasonal influenza H1N1 virus detection

图4 实时荧光定量PCR检测季节性流感病毒H1N1的熔解曲线Fig.4 Melting curve of real-time PCR for seasonal influenza H1N1 virus detection

如图4所示，所有标准品均在83.2℃出现尖且窄的特异性熔解峰。将荧光定量PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示，特异性条带亮度随模板拷贝数梯度降低而等倍下降。综上评估结果，可见本定量检测系统灵敏度达102copies/μL，无非特异性扩增，定量结果真实可靠。

图5 实时荧光定量PCR检测季节性流感病毒H1N1后琼脂糖凝胶电泳结果Fig.5 Results of electrophoresis after the real-timePCR for seasonal influenza H1N1 virus detection

2.4 重复性验证

将9个梯度样品均平行设三个重复样，PCR重复三次，统计Ct的的平均值、标准差（SD）及变异系数（CV），结果如表1所示，CV值均低于1％，证明所有数据重复性良好，检测系统非常稳定。

表1 实时荧光定量PCR检测季节性流感病毒H1N1数据的重复性验证Tab.1 Reproducibility of the real-time PCR for seasonal influenza virus H1N1 detection

3 讨论

流感病毒的实验室诊断方法包括病毒细胞培养、血清学诊断以及抗原检测。病毒通过感染敏感的组织细胞可以被分离鉴定出来，这可以作为流感病毒感染最直接，最可靠的依据。另外，急性期血清较恢复期血清抗体有4倍增加也是流感病毒感染的标准。但是前者耗时长，一般来说细胞培养需要3～4 d，而后者需采集患者急性期及恢复期双份血清进行抗体测定，且很容易出现与其他亚型的交叉反应，这些缺陷限制了两种方法在临床上的快速诊断。抗原的直接检测包括对病毒结构蛋白以及核酸的检测。病毒结构蛋白的检测基于抗原抗体的反应、偶联酶或者化学生色原或者荧光染料，包括免疫荧光（immunofluorescence，IF）、酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assays，ELISA），直接或间接免疫荧光试验的敏感度波动在40％ ～100％，特异性在86％ ～99％，但是由于需要荧光显微镜特殊仪器而限制了其在临床上的应用。目前对流感病毒抗原核酸的最优检测手段是实时荧光定量PCR反应，它将高灵敏性、高特异性和高准确性结为一体，克服了传统PCR费时、易污染、低通量等缺点，可对样本中的流感病毒核酸进行准确的定量检测［5-7］。

SYBR GreenⅠ是一种结合于双链 DNA小沟中的荧光染料，与双链 DNA结合后，其荧光大大增强，这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。在 PCR反应体系中，加入过量SYBR GreenⅠ荧光染料，其特异性地掺入 DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR产物的增加完全同步［8］。

SYBR GreenⅠ在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链 DNA相结合，因此通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链 DNA熔点的性质，通过熔解曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定。此外，由于一个 PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SYBR GreenⅠ的灵敏度很高。但是，由于 SYBR GreenⅠ与所有的双链 DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响［9］。

NP基因在流感病毒的8个基因片段中相对保守［1］，选取NP基因作为扩增的模板能兼顾同亚型不同毒株之间的保守序列，保证了该检测方法对于H1N1病毒的通用性。同时，在进行引物设计时，注意同流感病毒H3、H5、H7、H9等其它亚型之间的序列比较，选取的序列应与其它亚型有较大差异，以保证扩增的特异性。将上、下游引物进行BLAST分析，结果发现与上、下游引物完全匹配的序列都是H1N1亚型序列，除此以外没有找到与引物有很大相似性的其它核酸序列。PCR产物电泳检测没有发现任何非特异性条带，表明PCR扩增的特异性。

季节性流感病毒H1N1的RT-PCR检测灵敏度在1000 copies/μL左右，从病毒核酸提取、RT-PCR反应到琼脂糖凝胶电泳，整个过程大约需要6～7 h左右，而本方法灵敏度可达100 copies/μL，比普通RT-PCR提高了10倍左右，从核酸提取至完成检测，仅需要4 h左右，并且能同时实现多样本的高通量检测。

综上所述，我们建立了一套快速定量检测季节性流感病毒H1N1的方法，特异性及灵敏度高，可用作基础及临床实验室对季节性流感病毒H1N1感染的辅助诊断方法和临床效果的监测手段，对实验操作者要求相对较低，具有实际的临床应用价值。

（本研究成果已申请专利，专利受理号： 201010278683.9。感谢香港大学陈鸿霖教授提供季节性流感病毒H1N1分离株A/Brisbane/59/2007。）

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