光剥夺导致大鼠抑郁样改变及其机制研究

王为 赵广宇 刘煜 李柱一 宿长军

光剥夺导致大鼠抑郁样改变及其机制研究

王为*赵广宇*刘煜*李柱一*宿长军*

目的 探讨长时间光剥夺是否导致大鼠的抑郁样改变，并从中枢甘丙肽水平和神经元凋亡角度探讨可能的病理机制。方法 随机选取实验组及对照组大鼠各12只，分别经持续避光及正常光照条件下饲养6周后，以强迫游泳实验中的静止时间判定大鼠的抑郁表现，以免疫荧光染色法检测大鼠脑部的甘丙肽水平及神经元凋亡情况。结果 光剥夺组大鼠体重增加量及日均摄食量均低于光照组［(239.23±30.88)g vs(310.85±30.59)g，P＜0.01;(31.25±2.10)g vs(39.55±1.51)g，P＜0.01］，在强迫游泳实验中的静止不动时间较光照组延长［(135.81±8.84)s vs(56.33±7.26)s，P＜0.05］，而中缝背核和蓝斑处的甘丙肽水平(以积分光密度表示)降低［(37.23±3.77)vs(29.25±2.95)，P＜0.05;(19.52±0.72)vs(5.13±2.68)，P＜0.01］，但并未观察到神经元凋亡。结论 长时间光剥夺可导致大鼠出现抑郁样表现，中枢甘丙肽水平的降低可能参与了这一过程。

抑郁 甘丙肽 光剥夺

目前对于抑郁症的非药物治疗有光照疗法等数种方式［1］，而在一种特定类型的抑郁症－季节性情感障碍(Seasonal Affective Disorder，SAD)中，疾病的发生发展随着不同季节中光照节律的变化而变化［2］。因此，光照改变导致的昼夜节律改变可能与抑郁症的发生发展有一定联系，但二者的关系仍须进一步明确且相关机制仍不清。有研究显示，光剥夺后大鼠中枢神经系统的蓝斑去甲肾上腺素神经元等单胺能神经元有凋亡现象［3］;而抑郁症的发生发展与中枢神经系统的多种神经递质密切相关，其中近年的研究已显示中枢甘丙肽(Galanin)水平的异常可能与抑郁症相关［4－6］，甘丙肽在中枢分布最丰富的区域正是蓝斑等脑区［4］。为此本研究拟建立大鼠的光剥夺模型，并从蓝斑等脑区中枢甘丙肽水平的变化和神经元凋亡两方面来探讨大鼠抑郁的可能机制，为抑郁症的病因机制探索积累科学资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物及光剥夺模型的建立 体重150 g～180 g雄性SD大鼠24只，随机分为光剥夺组和光照组各12只。前者始终置于暗室;后者置于正常光照房间，照明时间为8:00～18:00。各组每个鼠笼内饲养2只大鼠，鼠笼集中并列放置以尽量保持实验条件一致。每2～3天添加食水，每4～6天更换垫料，共饲养6周。各项日常操作，光剥夺组在弱红光照明条件下迅速进行。为消除行为学实验中体重、体能等方面的差异可能对大鼠单纯运动能力带来的影响，另设置光照－2组大鼠6只。光照－2组饲养条件同光照组，但饲养时间缩短为4～5周，以保持与光剥夺组相同的体重。

1.2 强迫游泳实验 模型建立后，光剥夺组及光照组各随机选取6只大鼠，另选光照－2组6只大鼠，进行强迫游泳实验检验大鼠的抑郁状态。选用直径40 cm×高70 cm透明树脂圆形水槽，水深40 cm，水温28～30℃。实验首日每只大鼠适应性游泳15 min。次日正式实验，每只大鼠游泳5 min，并全程录像。参考既往相关研究［7］，将大鼠的活动分为三类:静止不动行为，即大鼠漂浮无动作或除了为避免没入水中而划水外再无其他行为;挣扎和攀爬行为，即大鼠持续用力沿水槽内壁向上攀爬，试图摆脱水环境;游泳和下潜行为，即大鼠在水槽内四周游动或主动下潜。由未参与此研究的两名实验员判读实验录像，记录“静止不动行为”的总时间作为“静止时间”。

1.3 大鼠中枢甘丙肽水平及神经元凋亡的检测 均采用免疫荧光染色法。模型建立后，光剥夺组及光照组各选取6只未参加强迫游泳实验的大鼠，进行免疫荧光染色，观察甘丙肽水平的变化及相关部位神经元凋亡情况。大鼠经常规灌注固定后取脑，冰冻切片机连续冠状切片，片厚30μm。选取中缝背核、蓝斑处切片，以0.3%Triton X－100处理30 min后分别入一抗:甘丙肽 H－80(Santa Cruz;1∶500)、抗－聚二磷酸腺苷核糖聚合酶p85片段(poly ADP－ribose polymerase p85，PARP p85)抗体(Promega;1∶500)，4 ℃孵育 24 h。二抗选用Alexa Fluor594驴抗兔IgG(Invitrogen;1∶500)，室温孵育3 h。贴片封片后于荧光显微镜下观察采图。

观察神经元凋亡时，取体重250～300 g雄性SD大鼠6只，采取线栓法制备大脑中动脉缺血－再灌注(middle cerebral artery occlusion/ischemic reperfusion，MCAO/IR)模型［8］作为阳性对照。模型建立24 h后，将大鼠常规灌注固定并取脑切片，切片部位广泛选取，包括蓝斑、中缝背核、皮层、下丘脑等。染色方法同前。

在针对甘丙肽的免疫荧光染色中，选取相同放大倍数、相同曝光时间的图片，采用Image－Pro Plus软件进行分析。分别在各图片的中缝背核、蓝斑对应处选取等大的测量区域，统计该区域内的积分光密度(integral optical density，IOD)。

1.4 数据统计处理 所有数据采用SPSS 16.0分析。结果均以均值±标准差(¯x±s)表示。两组间比较采用两样本的t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步的两两比较采用 SNK(Student－Newman－Keuls)检验。检验水准α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 大鼠体重、摄食量的比较 经6周避光饲养后，光剥夺组大鼠体重增加量明显小于光照组(t=5.71，P＜0.01)。同时，光剥夺组大鼠第5～6周期间的日均摄食量明显低于光照组(t=11.09，P＜0.01)。见表1。

2.2 强迫游泳静止不动时间的比较 进行强迫游泳试验的光剥夺组、光照组、光照－2组大鼠各6只，3组的体重有明显差异(F=8.40，P＜0.01)。其中，光剥夺组与光照－2组体重均低于光照组(q=4.31，P＜0.05;q=5.30，P＜0.05)，但二者无明显差异(q=1.79，P＞0.05)。3组强迫游泳的静止时间差异有统计学意义(F=202.07，P＜0.01)，其中光剥夺组的静止时间明显长于光照组(q=25.23，P＜0.05)及光照－2组(q=23.96，P＜0.05)，而后两者间的差异无统计学意义(q=1.27，P＞0.05)。见表1。

2.3 中枢甘丙肽水平和神经元凋亡情况的比较 与光照组比较，光剥夺组大鼠中缝背核、蓝斑处甘丙肽荧光强度均明显减弱(t=3.59，P＜0.05;t=14.82，P＜0.01)。见图1和表1。在光剥夺组及光照组大鼠脑内(包括中缝背核和蓝斑)均无提示神经元凋亡的PARP p85阳性细胞出现。而在作为阳性对照的MCAO/IR模型大鼠多个脑区域发现大量PARP p85阳性细胞，在皮层处尤为明显。见图2。

表1 各组大鼠体重增加量、日均摄食量、强迫游泳实验静止时间和中枢甘丙肽水平的比较

图1 免疫荧光显示大鼠中枢甘丙肽水平变化情况。图A、C示光剥夺组大鼠中缝背核和蓝斑甘丙肽表达情况;图B、D示光照组大鼠中缝背核和蓝斑甘丙肽表达情况。Aq:大脑水管;DR:中缝背核;4V:第四脑室;LC:蓝斑

图2 长期光剥夺大鼠中缝背核和蓝斑内未见凋亡神经元出现。图A～D示光剥夺组大鼠(A，C)和光照组大鼠(B，D)中缝背核(A，B)和蓝斑内(C，D)内均未见凋亡神经元。图E示MCAO/IR模型组大鼠大脑皮层内出现大量凋亡的神经元。Aq:大脑水管;DR:中缝背核;4V:第四脑室;LC:蓝斑

3 讨论

在美国的精神障碍诊断与统计手册第4版中，SAD已不再被单独列为一种情感障碍，而是重性抑郁障碍(Major Depressive Episode)的一种特殊类型。这一分类，反映了SAD与抑郁症之间的密切联系，也提示了利用光剥夺方法进行研究，很可能对认识更多类型抑郁症的发病机理提供帮助。本研究通过模仿SAD发生发展中的重要因素－低光照，建立了大鼠的光剥夺模型，观察了光剥夺后大鼠抑郁程度以及其中枢神经系统内甘丙肽水平的变化。结果显示，经过6周光剥夺，大鼠的摄食量和体重增加量均明显低于对照组，且在校正体重差异带来的影响后，其在强迫游泳实验中的静止时间明显延长。结合抑郁症患者通常出现饮食减少、体重减轻的症状，并参考慢性非预见性应激抑郁模型大鼠在强迫游泳实验中的表现［9］，可以认为，光剥夺6周后的大鼠出现了抑郁样表现。

本研究结果显示，与正常光照组比较，光剥夺组大鼠还出现了中缝背核、蓝斑处甘丙肽水平的降低。中缝背核、蓝斑是中枢神经系统内甘丙肽表达最为丰富的区域［10］，这些位置甘丙肽水平的变化可反映整个中枢甘丙肽水平的变化。研究表明，中枢神经系统内的甘丙肽标记物通常与胆碱能、儿茶酚胺能、5－羟色胺能的标记物共存。尤其值得注意的是:在中缝背核处，大多数色氨酸羟化酶阳性的神经元都会同时表达中等程度的甘丙肽［11］，前者是5－羟色胺合成的限速酶;与此类似，蓝斑处的甘丙肽与多巴胺β－羟化酶的标记物几乎呈完全共存［11］，后者是去甲肾上腺素能神经元的重要标记物。抑郁症的发生发展与多种神经递质的异常有关，其中就包括5－羟色胺以及去甲肾上腺素等单胺类递质［12－13］，而甘丙肽可能正是通过与这些递质及其受体的相互作用，参与了抑郁症的发生发展［4，14］。此前的研究发现，光剥夺可以导致中枢神经系统单胺类递质的水平下降［3］，而本研究更进一步明确了光剥夺后甘丙肽水平的下降。结合上述结果，可推测光剥夺可能通过影响了包括甘丙肽在内的多种神经递质的水平，导致了抑郁状态的发生。

Gonzalez等［3］的研究显示光剥夺导致了蓝斑去甲肾上腺素能神经元等单胺能神经元处于“凋亡过程中的初级阶段”，其结论是依据PARP p85免疫荧光染色的图片。细胞发生凋亡时，PARP被酶切为分子量85kDa(即PARP p85)和25kDa的两个片段，从而丧失其DNA修复功能，因此PARP p85的水平上升可用来反映凋亡发生情况［15］。参照该论文［3］的图片，本研究偶见类似的PARP p85弱阳性细胞，但数量极少且荧光强度很弱，很难与背底染色区别;同时在光剥夺组和光照组均有发现，分布区域也不局限于中缝背核、蓝斑处。因此，提示PARP p85弱阳性细胞并不能反映出神经元处于凋亡前期状态，光剥夺后是否存在神经元凋亡有待进一步探讨。同时，提示本研究观察到光剥夺后大鼠中缝背核、蓝斑处甘丙肽水平的下降并非由神经元凋亡引起，其具体原因有待进一步研究。

本研究成功建立了大鼠的光剥夺模型，进一步证实了甘丙肽与抑郁症之间可能存在联系，为了解SAD以及其它类型抑郁症的发生发展提供了新的思路。但是，甘丙肽只是中枢诸多递质中的一种，光剥夺是否还影响了其它递质、递质水平变化的具体机制仍有待进一步研究。

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Effect of long-tim e light dep rivation on depression and the possible pathologicalmechanism.

WANGWei，ZHAO Guangyu，LIU Yu，LIZhuyi，SU Changjun.Department of Neurology，Tangdu Hospital，Fourth Military Medical University，17West Changle Road，Xian 710032.China.Tel:029 －84777743.

ObjectiveTo investigate the impact of long－time light deprivation on depression－like behavior，and probe into the possible pathologicalmechanism with focus on central galanin level and apoptosis.MethodsTwelve rats were kept in constant darkness for 6 weeks and 12 rats housed in a normal light－dark schedule served as controls.The immobility time in forced swim test(FST)was used to determine the extent of depression and immunofluorescence staining was employed to examine galanin expression aswell as apoptotic neurons in the ratbrain.ResultsRats from the light deprivation group showed a decrease in both body－weightgain and food－intake compared with control rats ［(239.23 ±30.88)g vs(310.85±30.59)g，P＜0.01;(31.25±2.10)g vs(39.55±1.51)g，P＜0.01］.FST data showed that rats treated with 6 week－light deprivation showed a longer immobility time compared with controls ［(135.81 ±8.84)s vs(56.33 ±7.26)s，P＜ 0.05］.Immunofluorescence staining detected a reduction of galanin level，as evidenced by integral optical density，in the dorsal raphe nucleus and locus coeruleus［(37.23±3.77)vs(29.25±2.95)，P＜0.05;(19.52±0.72)vs(5.13 ±2.68)，P＜0.01］，but not detect any apoptotic cell in the brain of rats treated with 6 week－light deprivation.ConclusionLong－time light deprivation leads to depression－like behavior in rats.The down－regulation of galanin level in the rat brainmay be involved in long－time light deprivation－induced depression－like behavior.

Depression Galanin Light deprivation

R749.4

A

☆国家自然科学基金资助项目(编号:30970945)，“973”课题资助项目(编号:2007CB512303)

* 第四军医大学唐都医院神经科(西安 710032)

(E－mail tdneurob@fmmu.edu.cn)

2010－10－22)

(责任编辑:曹莉萍)

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