Livin和Smac在大肠癌组织中的表达及相关性分析

彭淑梅 严 红 罗 欣 (井冈山大学医学院临床系实验室，江西 吉安 343000)

Livin和Smac在大肠癌组织中的表达及相关性分析

彭淑梅 严 红 罗 欣1(井冈山大学医学院临床系实验室，江西 吉安 343000)

目的 检测Livin和Smac在人大肠癌组织中的表达并分析其临床意义。方法 收集42例大肠癌组织和22例正常大肠组织，用免疫组织化学方法和RT－PCR检测Livin和Smac的蛋白及mRNA表达情况。结果 大肠癌组织中Livin的表达率高于正常大肠组织(P＜0.001)，Smac的表达率则低于正常大肠组织(P＜0.001)，Livin与Smac的表达呈负相关(P＜0.05)。结论 Livin和Smac可能是大肠癌细胞凋亡信号传导通路中的重要环节。

Livin;Smac;大肠癌;凋亡

近年来，诱导肿瘤细胞凋亡成为大肠癌防治的热点之一。Livin是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)的成员之一，对抑制细胞凋亡起着重要作用〔1〕。Smac是新近发现的直接抑制IAPs的蛋白，能够与Livin结合成Smac－Livin复合物，解除Livin的抑制作用，发挥促凋亡作用〔2〕。本研究检测大肠癌组织和正常大肠组织中Livin和Smac的蛋白及mRNA表达，旨在探讨两者在大肠癌发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2009年3月至2010年10月井冈山大学附属医院手术切除的大肠癌标本42例，其中男22例，女20例，年龄30～79岁，中位年龄56.5岁。按Dukes分期分类:A期7例，B期15例，C期15例，D期5例。患者术前均未采用放疗、化疗或针对肿瘤的其他治疗，术后均经病理学诊断证实。22例正常对照标本取自经病理证实无肿瘤残留的结直肠癌手术切除标本的切缘。

1.2 方法

1.2.1 Livin蛋白和Smac蛋白的检测 手术标本用10%甲醛固定24 h，常规石蜡包埋、切片，苏木精－伊红(HE)染色，阅片证实为结直肠腺癌或正常组织。另取切片行免疫组织化学染色，采用PV－9000二步法，二氨基联苯胺(DAB)显色。免抗人Livin多克隆抗体为博士德生物工程有限公司产品，浓度为1∶50。兔抗人Smac多克隆抗体为Cell Signaling Technology公司产品，浓度为1∶200。PV－9000购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2 蛋白检测结果判断 Livin和Smac阳性染色为棕黄色颗粒，主要在胞质中表达。每张切片在10×40倍光镜下随机观察5个视野，计算阳性细胞数。分级方法如下:染色强度，不着色为0，轻度着色为1，中度着色为2，强着色为3;阳性细胞所占百分比:无着色比为0，＜10%为1，10% ～50%为2，＞50%为3。两种积分相加，依照0为(－)、1～2为(+)、3～4为()、5～6为()，进行半定量判断:(－)为阴性、(+)为弱阳性、()为阳性、()为强阳性，进行统计学分析时(+～)皆为阳性。

1.2.3 Livin mRNA和Smac mRNA的检测 手术标本离体后立即放入高压灭菌后的冻存管中，液氮冻存，尽快提取RNA。RT－PCR扩增产物经1.5%琼脂糖电泳，通过Band Scan图像分析软件读取目的电泳条带的灰度值，以β－actin条带的灰度值标化其相应的 Livin α、Livin β和 Smac表达量。用 Primer5.0软件设计引物，由上海生工生物技术公司合成。Livin的上游引物为 5′CGCACGGCACAAAGACGA 3′，下游引物为 5′GTCAGTTCCTGCTCCGGTCAA 3′，Livin α 与 Livin β 的产物长度分别为351 bp和297 bp。内参照 β－actin的上游引物为 5′AGCCATGTACGTAGCCATCC 3′，下游引物为 5′CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA 3′，扩增片段为228 bp。Livin和β－actin反应条件:95℃预变性5 min，然后 94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 1 min 扩增 32 个循环，最后72℃延伸10 min。Smac的上游引物为5′GTGCGGTTCCTATTGC 3′，下游引物为 5′GATTCCTGGCGGTTAT 3′，扩增片段为393 bp。反应条件:95℃预变性5 min，然后94℃ 30 s、43℃ 30 s、72℃ 1 min扩增32个循环，最后72℃延伸10 min。

1.3 统计学分析 应用SPSS12.0统计软件，率的比较采用χ2检验，相关性用Spearman相关分析。计量资料采用t检验。

2 结果

2.1 两组中Livin蛋白和Smac蛋白表达情况的比较 大肠癌组织中Livin蛋白阳性表达率为66.7%(28/42)，而正常大肠组织仅为13.6%(3/22)，大肠癌组织明显高于正常大肠组织(χ2=16.256，P＜0.001)。Smac蛋白在大肠癌组织中的阳性表达率为42.9%(18/42)，正常大肠组织阳性表达率为72.7%(16/22)，高于大肠癌组织(χ2=5.173，P ＜0.05)。

2.2 两组中Livin mRNA和Smac mRNA表达情况的比较

Livin α mRNA和Livin β mRNA在大肠癌组织中的表达明显高于正常大肠组织(P＜0.001)，而Smac mRNA在大肠癌组织中的表达明显低于正常大肠组织(P＜0.001)。见表1。

表1 两组Livin、Smac mRNA表达情况的比较(±s)

表1 两组Livin、Smac mRNA表达情况的比较(±s)

组别 n Livin α mRNA Livin βmRNA Smac mRNA大肠癌组42 0.597±0.100 0.578±0.090 0.105±0.055正常组 22 0.123±0.083 0.127±0.070 0.563±0.067 F值 0.388 0.885 1.362 P值0.000 0.000 0.000

2.3 大肠癌组织中Livin与Smac表达的相关性分析 大肠癌组织中Livin蛋白与Smac蛋白共阳性表达15例，共阴性表达11例，仅Livin阳性13例，仅Smac阳性13例，二者表达呈负相关(r= －0.387，P ＜0.05)。并且，大肠癌组织中 Livin α、Livin β mRNA与 Smac mRNA表达也呈负相关(r=－0.493，P ＜0.05;r= －0.476，P ＜0.05)。

3 讨论

IAPs家族是一类独立于Bcl－2的抗凋亡蛋白，均含有IAP同源序列(BIR)和RING指结构域，能够抑制细胞凋亡，与肿瘤的发生、发展有重要关系〔3〕。Livin又称肾IAP(KIAP)，是新近发现的人类IAPs家族成员〔4〕，基因位于X染色体20q13.3，其转录产物因剪切方式不同有两种 mRNA亚型:Livin α和Livin β，分别编码298和280个氨基酸的蛋白质，两者除相差一段54 bp以外，其他完全一致〔5〕。Smac是目前发现的唯一存在于哺乳动物细胞中直接抑制IAPs的蛋白，在正常组织中分布较广泛〔6〕。其前体存在于正常细胞线粒体中，在凋亡信号刺激下释放至细胞质，经修饰形成成熟的Smac。Smac可直接与Livin结合成Smac－Livin复合物，与半胱氨酸蛋白酶(caspase)竞争结合BIR结构，使Livin的BIR功能区失去活性，解除Livin的抑制作用，从而释放活化的caspase而下调其抗凋亡活性〔7〕。

目前，Livin和Smac在大肠癌的表达及相互关系国内外研究很少。国外研究显示，Livin在很多人类恶性肿瘤中高表达，如黑色素瘤、膀胱癌、胰腺癌细胞系及结肠癌细胞系、非小细胞肺癌、前列腺癌细胞〔8〕。本研究结果显示正常大肠组织中Smac表达显著高于大肠癌组织，而大肠癌组织中Livin的表达显著高于正常大肠组织，不仅从蛋白表达水平，还从mRNA表达水平证实了这一点。因此，预示Livin可作为一种新的肿瘤抗原来检测胃肠道肿瘤，Livin有希望成为大肠癌发生早期阶段的分子标记物和诊断指标。

Spearman等级相关分析显示大肠癌组织中Livin蛋白与Smac蛋白表达呈负相关。Pearson相关分析从mRNA表达水平也证实了两者的负相关性。这提示Livin和Smac的表达可能存在负反馈调节或者相互拮抗关系，可以推测Smac通过与Livin结合而抑制后者的抗凋亡活性，发挥促凋亡作用。是否还存在其他途径发挥拮抗作用有待进一步的研究。现已有研究证明将Smac cDNA转染肾细胞癌细胞能提高其对促凋亡刺激的敏感性〔9〕，因而Smac对肿瘤的治疗有重要作用。

Livin和Smac的表达关系可能是大肠癌细胞凋亡信号传导通路中的重要环节。对Livin和Smac在大肠癌中相互关系的研究将有助于寻找IAP抑制剂，从而将促进肿瘤细胞凋亡发展为肿瘤治疗的新靶点。

1 Vucic D，Stennicke HR，Pisabarro MT，et al.ML－IAP，a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas〔J〕.Curr Biol，2000;10(21):1359－66.

2 Du C，Fang M，Li Y，et al.Smac，a mitochondrial protein that promotes cytochrome c－dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition〔J〕.Cell，2000;102(1):33－4.

3 Crook NE，Clem RJ，Miller LK.An apoptosis－inhibiting baculovirus gene with a zinc finger－like motif〔J〕.J Virol，1993;67(4):2168－74.

4 Lin JH，Deng G，Huang Q，et al.KIAP，a novel member of the inhibitor of apoptosis protein family〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2000;279(3):820－31.

5 Ashhab Y，Alian A，Polliack A，et al.Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different biological properties and tissue distribution pattern〔J〕.FEBS Lett，2001;495(1－2):56－60.

6 Chai J，Du C，Wu J，et al.Structural and biochemical basis of apoptotic activation by Smac/DIABLO〔J〕.Nature，2000;406(6798):855－62.

7 Vucic D，Deshayes K，Ackerly H，et al.SMAC negatively regulates the anti－apoptotic activity of melanoma inhibitor of apoptosis(ML－IAP)〔J〕.J Biol Chem，2002;277(14):12275－9.

8 Kasof GM，Gomes BC.Livin，a novel inhibitor of apoptosis portein familly member〔J〕.J Biol Chem，2001;276(5):3238－46.

9 Mizutani Y，Nakanishi H，Yamamoto K，et al.Downregulation of Smac/DIABLO expression in renal cell carcinoma and its prognostic significance〔J〕.J Clin Oncol，2005;23(3):448－54.

R735.3

A

1005-9202(2011)12-2190-02

2010年江西省教育厅科技计划项目青年项目(GJJ10204)

1 吉安市第三人民医院

彭淑梅(1970－)，女，实验师，主要从事临床实验工作。

〔2011－02－11 收稿 2011－04－22 修回〕

(编辑 袁左鸣/徐 杰)