激发荧光扫描法测定微量丹皮酚的研究

李晓燕， 许红辉， 韩桂茹， 李向军， 冷仲秋

(1.河北以岭医药研究院，河北石家庄050035;2.河北省药品检验所，河北石家庄050011;3.河北承德隆化卫校，河北承德068150)

丹皮酚为中药牡丹皮中的主要活性成分，具有抗心律失常，抗动脉粥样硬化，抗高血压及抗菌、抗变态反应和增强免疫的药理作用【1】。牡丹皮为一种常用中药材，配伍在多种成方制剂中，仅《中国药典》2005年版一部收载的成方制剂中含牡丹皮的品种就有35种。丹皮酚的含量测定方法主要为高效液相色谱法【2】，其次是薄层扫描法【3】，扫描法多在(274±1)nm处进行扫描测定，供试品溶液的浓度相对较高(0.5 mg/mL)，线性范围在1～5 μg，对丹皮酚含量低微的样品，扫描法根本无法检出。遇到高效液相法丹皮酚波峰有干扰的情况下，定量测定就更难以进行。为开发丹皮酚不同形式的、高灵敏度测定方法，对丹皮酚进行增荧光后，荧光薄层扫描定量测定研究，获得理想的测定结果，大幅度提高了丹皮酚的检测灵敏度以及方法的重现性和精密度。从测定的简便性、快捷性、灵敏性与测定成本等多因素综合比较，丹皮酚的激发荧光扫描法有优于高效液相法的趋势，为丹皮酚的高灵敏度测定提供了新途径。报道如下:

1 材料、仪器与试剂

1.1 材料 牡丹皮药材由安国以岭中药饮片有限公司提供;清胃黄连蜜丸(批号:071149)由内蒙古伊泰丹龙药业提供;清胃黄连水丸(批号:20080201)由山西旺龙药业提供:养阴清肺丸(批号:9013041)由北京同仁堂制药厂提供;丹皮酚对照品(批号110708-200505)购自中国药品生物制品检定所。微量定量点样毛细管(美国)。

1.2 仪器 CS-9301PC薄层色谱扫描仪(日本岛津)。

1.3 试剂 硅胶G(青岛海洋化工厂，批号:060214)。其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 取丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，即得。

2.2 供试品溶液的制备 取样品粉末或蜜丸碎粒适量(约相当牡丹皮药材0.15 g)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，摇匀，称定重量，如为蜜丸浸泡10 h以上，用玻棒研磨使样品溶散，用数滴甲醇冲洗玻棒于锥形瓶中，超声处理(功率300 W，频率50 KHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足或挥散至原重量，滤过，精密量取续滤液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 薄层色谱扫描条件 荧光法单波长线性扫描;激发波长292 nm，1号滤光片，线性化参数SX=3;线性回归二点法计算含量。

2.4 测定波长及滤光片的选择 精密吸取上述供试品溶液与对照品溶液，交叉点于同一薄层板上，展开，晾干，增荧光，在不同的滤光片下，逐波长进行激发，记录荧光强度的积分值(见表1)，并以波长为横坐标，荧光强度积分值为纵坐标，分别绘制荧光强度积分曲线，得1号、2号滤光片二条曲线(见图1、2)。3号滤光片下强度积分值太小，4号滤光片下无强度积分值。从图1、2数值可见，1号与2号滤光片荧光强度稍有区别，但最大吸收均在292 nm，1号滤光片下荧光强度较2号滤光片荧光强约1 000，因此选择1号滤光片，激发波长定为292 nm。

图1 1号滤光片激发扫描图

2.5 薄层定量测定 精密吸取供试品溶液2～4 μL、对照品溶液2 μL与6 μL，分别交叉点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-丙酮-甲酸(8:2:1:0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液进行增荧光反应，置紫外光灯(365 nm)下定位。采用激发波长λ=292 nm，进行荧光扫描，用线性回归二点法计算含量。样品和牡丹皮药材的测定结果见表2:

表1 丹皮酚在不同滤光片下荧光强度积分值

图2 2号滤光片激发扫描图

2.6 标准曲线 在同一块薄层板上，分别点2、3、5、6、7、9 μL丹皮酚对照品溶液(20.1 μg/mL)，按样品测定项下的条件展开，晾干，增荧光后，进行荧光扫描测定。以浓度为横坐标，荧光强度的积分值为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明:对照品的点样量在0.040 2～0.180 9 μg范围内，与荧光强度的积分值呈良好的线性关系，回归方程为Y=27.89X+982.79，r=0.999 7。

表2 样品与牡丹皮药材含量测定结果

2.7 同板精密度试验 在同一块板上交叉点丹皮酚对照品与样品溶液各5个点，展开，晾干，增荧光后，扫描测定。对照品的RSD为1.59%，样品的RSD为0.81%。

2.8 异板精密度试验 在不同的薄层板上，交叉点丹皮酚对照品与供试品溶液，展开，晾干，增荧光后，扫描测定，并计算含量，样品的平均含量为25.68 mg/g，RSD为1.31%。

2.9 仪器精密度试验 在薄层板上交叉点对照品溶液与供试品溶液各3 μL，展开，晾干，增荧光后，对照品与供试品的斑点各连续扫描5次，记录荧光强度积分值，结果表明:对照品的RSD为0.59%，样品的RSD为0.09%，表明仪器性能良好。

2.10 稳定性试验 取丹皮酚对照品溶液与样品溶液各3 μL，交叉点于同一块薄层板上，展开，增荧光，每相隔一定时间，扫描测定一次，结果表明:荧光斑点稳定，在考察的1.5 h内，对照品的RSD为2.39%，样品的RSD为2.68%。

2.11 重复性试验 取同一批样品9份，分别取高(0.18 g)、中(0.15 g)、低(0.12 g)3个剂量，按供试品溶液的制备方法制备，展开，增荧光后，扫描测定。样品中丹皮酚的平均含量为25.62 mg/g，RSD%为1.83%。表明方法重复性良好。

2.12 回收率试验 采用加样回收实验。取同一批样品9份，分为3组，按高、中、低3个剂量，分别加入25 mL不同浓度的丹皮酚对照品甲醇溶液，进行超声提取，展开、荧光扫描测定，计算回收率。丹皮酚的平均回收率为101.80%，RSD为1.58%(n=9);测定结果见表3。

表3 丹皮酚含量回收率试验结果(n=9)

2.13 专属性实验 取空白(不含牡丹皮的样品)样品，按样品测定项下，提取，展开，增荧光，置紫外光灯(UV365 nm)下检视，在丹皮酚相应的位置上，无相同的荧光斑点出现，空白不干扰测定。色谱扫描，空白为一平滑的直线，无荧光吸收(见图3)，定量测定专属。

图3 丹皮酚定量测定TLC色谱图

2.14 最低检出限与最低定量限 对丹皮酚的最低检出限和最低定量限进行了考察，即取每1 mL含1 μg的丹皮酚对照品溶液，分别点2、3、4…13 μL，12 个点，展开，增荧光后，检测，4 μL的斑点即呈现明显的荧光斑点，其最低检出限为0.004 μg;再取每1 mL含10 μg的丹皮酚对照品溶液，分别点 1、2、3…5 μL，5 个点，展开，增荧光后，扫描测定，结果显示，点样量在0.03 μg荧光强度积分值在2 000左右，大小适宜，稳定，确定为最低定量限(见图4)。

3 讨论

图4 最低定量限图

3.1 丹皮酚是一种不呈现荧光的化合物，点于GF254薄层板，展开后，在紫外光灯(254nm)下浓度高时呈现出棕褐色斑点，浓度低时，无任何检测信息，无法检测或进行高灵敏度的扫描定量。与增荧光剂三氯化铝反应后，可呈现很强的亮蓝色荧光斑点，定性检出限度为0.004 μg，定量检出限为0.03 μg。通过丹皮酚无荧光到有荧光的质变，大幅度提高了丹皮酚的检测灵敏度，达紫外扫描法［3］的25倍以上，可与高效液相法相提并论，使样品中的微量丹皮酚有了简便、快捷的定性与定量新方法。其相当于每g成方制剂中只要含0.08 mg或3 mg牡丹皮药材即可进行定性检出和定量测定。这种高灵敏度的定性检出目前还无简便、快捷的其他方法能够取代(见图5)。

图5 各样品丹皮酚图谱

上述照片图1～3为清胃黄连丸中丹皮酚薄层图谱，是同一块薄层板。4～6为养阴清肺丸中丹皮酚薄层图谱，是同一块薄层板。其中1.3.5.7.9.11为样品，2.4.6.8.10为丹皮酚对照品。从照片可以看到两种样品，在未增荧光之前，不论是254 nm，还是365 nm下检视，在样品与丹皮酚对照品相应位置都无任何信息斑点，无法检出，但增荧光后，样品和对照品都出现了非常清晰的亮兰色荧光斑点，可用于丹皮酚简便、快捷的微量定性鉴别和定量测定。

3.2 目前为止，本作者已对数种无荧光化合物进行了增荧光研究，除了上述的丹皮酚增荧光定量测定外，还尝试了甾体化合物胆酸与硫酸乙醇液显色增荧光，选择激发波长(385±1)nm的定量测定［4］，使胆酸的检测灵敏度提高了10倍，干扰物质降低到1/10。增荧光的研究思路为同行提供了无荧光化合物的定性与定量测定新途径(见人工牛黄的薄层鉴别图6)。

3张照片是同一薄层板，为牛黄消炎片中人工牛黄TLC图，其中1.3.5样品，2.4.6胆酸。从照片可以看到在未增荧光之前，不论是254 nm，还是365 nm下检视，在样品与胆酸对照品相应位置都无任何信息斑点，无法检出，增荧光后，样品和对照品都出现了非常强的清晰亮兰色荧光斑点，而用于贵重药材人工牛黄的微量或痕量检出。对中成药中微量成分的质量监督，具有重要意义。

图6 人工牛黄的薄层鉴别

［1］郭 齐，李贻奎，王治国，等.丹皮酚药理研究进展［J］.中医药信息杂志，2009，26(1):20-22.

［2］中国药典［S］.一部.2005:119.

［3］刘义梅.薄层扫描法测定知柏地黄丸中丹皮酚含量［J］.湖北中医杂志，2005，27(7):52-53.

［4］李向军，韩桂茹，吴 广，等.荧光扫描法测定复方氨酚烷胺片中胆酸的含量［J］. 中国药业，2009，18(17):17-18.