雄性“肾阳虚”亚健康大鼠模型的研究

李天禹 ，何清湖 ，卢芳国 ，刘朝圣 ，万 胜

（1.遵义医学院附属医院中医科，贵州 遵义 410208；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学2008级博士研究生班，湖南 长沙 410208）

雄性“肾阳虚”亚健康大鼠模型的研究

李天禹1，何清湖2*，卢芳国2，刘朝圣2*，万 胜3

（1.遵义医学院附属医院中医科，贵州 遵义 410208；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学2008级博士研究生班，湖南 长沙 410208）

目的 研究雄性“肾阳虚”亚健康大鼠模型，为调理男性肾阳虚亚健康找寻科学配方。方法 控制用药剂量及灌胃时间，用维生素B4建立雄性“肾阳虚”亚健康大鼠模型，检测腺垂体－睾丸轴激素、氧化损伤因子及抗氧化损伤因子、睾丸组织微细结构作为判断亚健康组织学依据。结果 与正常大鼠相比较，模型大鼠血清FSH、LH、T均降低，均有统计学意义；模型大鼠血清SOD下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；MDA增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；模型大鼠睾丸组织曲细精管规则，管腔变大，精子尾部有融合现象，生精细胞层次减少，排列较紊乱，出现空泡现象。结论 运用维生素B4建立的雄性“肾阳虚”亚健康大鼠模型成功。

肾阳虚；亚健康；维生素B4；大鼠

亚健康状态是介于疾病与健康的身体低质状态。男性因其生理特点决定其亚健康状态在中医分型中主要体现为肾阳虚证。目前就男性亚健康模型的建立还没有报道，对男性亚健康的调理校正还没有行之有效的办法。探讨调理男性亚健康方法，建立雄性“肾阳虚”大鼠亚健康模型势在必行。根据亚健康的概念及亚健康的判断标准[1-2]，特尝试运用维生素B4建立雄性“肾阳虚”大鼠亚健康模型，现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选用 20只清洁级 Sprague-Dawley雄性SD雄性大鼠，体质量20 g，4月龄，由湖南农业大学动物实验室提供，合格证书：医动字第04057号。适应性喂养1周后随机分成两组：正常组及“肾阳虚”亚健康模型组，每组10只。

1.1.2 药物 维生素 B4（10 mg/片×100），浙江瑞新药业股份有限公司（生产批号：20090317）。

1.1.3 试剂 卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、睾酮（T）－放免分析药盒（北京科美东雅生物技术有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）－ELISA试剂盒（购于北京中山生物技术有限公司，美国R＆D公司产品）。

1.1.4 仪器 MK3酶标仪（芬兰雷勃公司产品）；Olympus光学显微镜（台湾）；RM2125石蜡切片机（德国 Leica公司产品）；AG204电子天平（瑞士梅托勒电子电器公司生产）；SORVALL Biofuge fresco 4℃离心机（德国）。

1.2 方法

1.2.1 模型制备及分组 维生素B4研末，用生理盐水溶解，配制浓度为1%。“肾阳虚”亚健康模型组大鼠灌胃剂量为 0.1 g/（kg·d），连续 10 d。正常组大鼠按2 mL/只灌胃生理盐水，连续10 d。

1.2.2 血清SOD活性、MDA含量的检测 各组大鼠麻醉后经腹主动脉取血约2 mL离心 (2 000 r/min)10 min，吸取血清采用ELISA法检测大鼠血清SOD、MDA的吸光值。运用ELISACalc工具将标准浓度及相关吸光值输入计算，再输入相关血清吸光值，计算出SOD活性、MDA含量。

1.2.3 血清FSH、LH、T浓度的检测 各组大鼠麻醉后经腹主动脉取血约2 mL离心 (2 000 r/min)10 min，吸取血清送湖南中医药大学第一附属医院同位素科采用放免法检测FSH、LH、T的浓度。

1.2.4 睾丸组织形态结构观察 各组大鼠麻醉后剖腹，取一侧睾丸，加入10%中性福尔马林液固定；常规石蜡包埋。Leica石蜡切片机连续切片，片厚5 μm，取蜡带贴于涂有蛋白甘油的载玻片上。常规苏木精－伊红染色，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固，光镜下观察。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 对各组大鼠血清SOD活性及MDA含量的影响

与正常组相比较，“肾阳虚”亚健康模型组大鼠活性降低(P＜0.05)，血清MDA含量增加，差异具有统计学意义(P＜0.01)，表明“肾阳虚”亚健康模型组大鼠抗氧化损伤作用降低，氧化损伤因素增强。结果见表1。

表1 维生素B4对大鼠血清SOD活性及MDA 含量的影响 （）

表1 维生素B4对大鼠血清SOD活性及MDA 含量的影响 （）

注:与正常组比较 *P＜0.05，◆P＜0.01。

组 别 n SOD(U/L) MDA(nmol/L)正常组 10 7.91±0.124 1.70±0.12模型组 10 5.59±1.66* 2.76±0.38◆

2.2 对各组大鼠血清FSH、LH、T浓度的影响

与正常组相比较，“肾阳虚”亚健康模型组大鼠血清 FSH(P＜0.01)、LH(P＜0.05)、T(P＜0.05)浓度均降低，差异均具有统计学意义。提示“肾阳虚”亚健康模型组大鼠腺垂体－睾丸轴各内分泌激素均降低。结果见表2。

2.3 对各组大鼠睾丸组织形态学结构的变化

正常大鼠睾丸曲细精管形态规则，各级生精细胞、精子层次分明(A，B)。“肾阳虚”亚健康模型组大鼠睾丸细胞仅处于变性阶段：曲细精管规则，管腔变大，出现精子尾部融合现象明显，各级生精细胞层次减少，排列较紊乱，有空泡现象出现，但没有出现细胞核浓缩、碎裂、溶解等坏死现象(C，D)。见图1。

表2 维生素B4对大鼠血清FSH、LH、T浓度的影响（）

表2 维生素B4对大鼠血清FSH、LH、T浓度的影响（）

注:与正常组比较 *P＜0.01，◆P＜0.05。

组 别 n FSH(mIU/mL) LH(mIU/ML) T(ng/DL)正常组 10 4.56±0.52 4.51±1.71 0.26±0.05模型组 10 3.12±0.85* 2.52±1.02◆ 0.07±0.05◆

图1 正常大鼠和“肾阳虚”亚健康模型大鼠睾丸组织比较（H.E.染色）

3 讨论

亚健康的界定标准：①排除疾病源因素的疲劳和虚弱状态；②介于健康与疾病之间的病前状态(中间状态)；③在生理、心理、社会适应能力和道德上的欠完美状态；④与年龄不相称的组织结构和器官生理功能的衰退状态[2]。在亚健康状态下，线粒体功能障碍，产生大量过氧化产物如MDA，大量消耗SOD等酶类[3]。亚健康的建模现在采用的是疲劳、睡眠剥夺、应激方法[4]，不能反映诸如形寒肢冷之类的“肾阳虚”亚健康表现。目前肾阳虚亚健康动物的造模方法，有干扰内分泌轴功能之嫌、无疾病状态及亚健康状态的明确界定[5]。选择维生素B4建立雄性大鼠“肾阳虚”亚健康模型，控制用药剂量及建模时间，既可确保肾阳虚证出现又可保证组织细胞变性而无结缔组织变性及细胞坏死，即同时满足了肾阳虚证的判断标准和亚健康的界定标准[2-3]。肾阳虚证人群中，血清FSH、LH、T均较正常人群显著降低[6]；肾阳虚模型小鼠血清SOD活性下降、MDA浓度升高[7]；维生素B4致肾阳虚大鼠睾丸组织萎缩、各级生精细胞变性、数量减少，精子产生明显减少（P＜0.01）[3]。

运用维生素B4建立肾阳虚亚健康模型，其结果显示：模型大鼠血清FSH、LH、T浓度均降低，出现肾阳虚证类似的内分泌激素改变结果；血清SOD水平下降及MDA浓度升高、睾丸组织细胞有变性改变，与肾阳虚证文献报道结果相似。考虑是因为维生素B4直接降低17β－羟类固醇脱氢酶的活性，将雄烯二酮还原为T能力减弱，导致T合成减少[8]；通过肾素－血管紧张素－醛固酮系统影响睾丸、下丘脑、腺垂体等器官组织血液循环来损害相应器官[9]，或者下调下丘脑、腺垂体对相应促激素、促激素释放激素；维生素B4代谢产物使组织中与糖、脂肪、蛋白质代谢有关的多种酶活性受抑制，影响了各组织的能量代谢所致[5]。根据组织损伤特点，引起细胞变性因素去除后，细胞形态和功能恢复正常，说明睾丸组织损伤处于可逆阶段，提示维生素B4建立的“肾阳虚”雄性大鼠亚健康动物模型是成功的：达到肾阳虚证的内分泌激素紊乱、氧化损伤增强及抗氧化损伤因素减弱的标准[3]，睾丸组织病理损伤仅在变性程度。

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（本文编辑 彭芝配）

Study on sub-health model of male Kidney-yang deficiency in rats

LI Tian-yu,HE Qing-hu,LU Fang-guo,LIU Chao-seng,WAN Sheng
(Affiliated Hospital,Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563000,China)

Objective To explore the sub-health model of male Kidney-yang deficiency in rats and look for a method for regulation of male Kidney-yang deficiency in human.Method Vitamin B4was used to set up the sub-health rats model of male Kidney-yang deficiency,the level of anterior pituitary-testiculus axle hormone,the content of oxidative damage factors and anti-oxidative damage factors, the fine structure of testicle tissue were detected to measure histological baseness in sub-health condition.Result Compared with normal rats,the levels of FSH,LH,T and SOD were decreased(P＜0.05),and content of MDA was increased(P＜0.01).the seminiferous tubule structure of testicle tissue was neat but lumen was expanded.There were the part-fusing in sperm tail,spermatogenic cell-staging decreased,ranged abnormal and existed the vacuolus. Conclusion Vitamin B4can be used to establish the sub-health model.

Kidney-yang deficiency;sub-health;vitamin B4;rats

* 刘朝圣，男，湖南浏阳人，副教授，博士，E-mail：chaoliu2807@sina.com。

R-332

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2011.01.006.022.03

2010－05－19

湖南省教育厅科学研究青年项目（08B057）；湖南省研究生科研创新基金项目（CX2009B173）。

李天禹（1966－），男，贵州遵义人，副教授，医学博士，研究方向：中西医结合男性病的研究。