星点设计－效应面法优化人参皂苷Rg1脂质体的制备工艺

周洪伟，周曼，侯德岩，王玉蓉

(1．北京中医药大学，北京 100102;2．沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110016)

人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1，以下简称Rg1)为四环三萜类衍生物，现代药理研究表明，Rg1具有保护神经元作用［1］，可改善老年动物衰退的行为活动功能［2］，增强阿尔茨海默病动物的学习记忆能力［3］。但Rg1易被肠道细菌所产生的酶降解，且在血液中消除快，直接口服生物利用度仅为1% ～20%［4］。脂质体作为新型药物载体，包封药物后可防止药物在肠道内被酶降解，且脂质体结构与细胞膜结构类似，可增强药物的跨膜吸收效果。效应面优化法(Response surface methodology，RSM)系通过描绘效应对考察因素的效应面，从效应面选择较佳的效应区，从而回推自变量取值范围即最佳实验条件，实验设计可采用星点设计(Central composite design，CCD)，该方法适用于非线性模型拟合，且具有良好的预测性［5］。因此，本文拟采用CCD－RSM法优化Rg1脂质体的制备工艺。

1 仪器与试药

HPLC系统:LC－20AT四元泵、DGU－20A5脱气机、CTO－10ASVP柱温箱、SPD－20A紫外检测器、SIL－20A自动进样器、色谱工作站(日本岛津公司)、Agilent eclipse XDB －C18柱(4.6mm ×250mm，5μm);XL－90型超高速离心机(美国BeckMan);JEM－1230型透射电镜(日本JEOL公司);RE－2000A型旋转蒸发仪(上海亚荣);KQ3200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);BSII0S型电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

人参皂苷Rg1对照品(中国食品药品检定研究院，批号 110703－200726，纯度:97．7%);人参皂苷Rg1药品(购自上海源叶生物科技有限公司，纯度＞98%);二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC(Avanti公司，纯度＞99%);胆固醇CH(Sigma公司，纯度＞99%);豆固醇ST(MP公司，纯度＞99%);甲醇、乙腈(色谱纯)。

2 方法与结果

2．1 脂质体的制备

采用薄膜分散法制备Rg1脂质体:精确称取处方量磷脂、固醇(M∶M=2∶1)共溶于甲醇－氯仿混合溶剂中(V∶V=1∶9)，置250ml梨形瓶内，于 40℃水浴减压旋转蒸发除去溶剂，待形成均匀的脂质薄膜后，加入Rg1药品水溶液，50℃水浴常压旋转水化60min，使脂质薄膜充分溶胀，水化完全后超声，即得Rg1脂质体。

2．2 包封率的测定

2．2．1 色谱条件

色谱柱:Agilent eclipse XDB－C18柱(4．6mm ×250mm，5μm);流动相:乙腈:水 =20∶80;流速:

作者简介:周洪伟(1982－)，男，北京中医药大学2009级中药制药学专业博士研究生，主要研究方向:中药复方新型释药系统研究。

通讯作者:王玉蓉(1951－)，女，教授，博士研究生导师，主要研究方向:中药复方新型释药系统研究。

收稿日期:2011－05－17

修回日期:2011－06－12

0.8mL/min;柱温:25℃;检测波长:203nm;进样体积:10μL。结果表明，该色谱条件下，辅料对人参皂苷Rg1的检测无干扰，如图1～3所示。

图1 DPPC/CH空白脂质体HPLC色谱图

图2 DPPC/ST空白脂质体HPLC色谱图

图3 人参皂苷Rg1 HPLC色谱图

2．2．2 标准曲线制作

精密称取经五氧化二磷减压干燥36h的Rg1对照品2．53mg，置10mL量瓶中，精密加入甲醇至刻度，摇匀，定容，即得 Rg1对照品溶液 A。取 Rg1溶液A 1 000μL和100μL，分别置 10mL 量瓶中，精密加入甲醇至刻度，摇匀，定容，即得Rg1对照品溶液B和Rg1对照品溶液C。精密吸取Rg1对照品溶液A 1、2、4、6、8、10、12μL，对照品溶液 B 2、4、6、8、10μL，对照品溶液 C 3、6、18、21μL，分别注入色谱仪，以峰面积(Y)对进样量(X)进行线性回归，得Rg1回归方程:Y=455 220X－4 275．7(R2=1)。结果表明 Rg1在7．415～2 996.172ng范围内线性关系良好。

2．2．3 精密度试验

取Rg1对照品溶液A，考察其日内、日间精密度。结果Rg1日内RSD为0.35%(n=5);日间RSD为2.99%(n=5)，精密度符合要求。

2．2．4 回收率测定

按2．1项下方法制备空白脂质体。分别精密加入45.2、22.6、11.3μg/mL 的 Rg1对照品溶液，制成高、中、低浓度的Rg1脂质体混悬液，甲醇破乳后定容至2mL，按2．2．1项下方法测定Rg1含量，计算回收率。结果DPPC/CH脂质体高、中、低浓度的回收率分别为(98.74±3.00)%、(95.72±3.20)%和(103.78±2.16)%，RSD分别为3.04%、3.34%、2.08%(n=3);DPPC/ST脂质体高、中、低浓度的回收率分别为(96.19±0.95)%、(103.79±3.69)%和(100.74±5.75)%，RSD分别为0.99%、3.56%、5.70%(n=3)，回收率良好。

2．2．5 药物纯度测定

依2．1．1项下方法测定所购药品 Rg1纯度，得Rg1纯度为99.15%，RSD=0.62%(n=3)，药物满足实验要求。

2．2．6 包封率(EF%)测定方法

采用高速离心法测定Rg1脂质体的包封率。精密量取 Rg1脂质体适量，置超高速离心机中，4℃，130 000×g离心60min，取上清液5mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，定容，超声，依2．1．1项下方法测定上清液中Rg1的含量(W1)。另精密量取Rg1脂质体5mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，定容，超声，依2．1．1项下方法测定 Rg1的含量(W2)，按公式(1)计算包封率。

2．3 脂质体制备工艺优化

在预实验基础上，选择Rg1药物百分含量(%)X1、水化时间(min)X2和水化温度(℃)X3为考察因素，以脂质体包封率(Y)为指标进行CCD－RSM法优化，X1范围为1～10%，X2范围为20～120min，X3范围为30～70℃。实验结果见表1～2。

表1 Rg1/DPPC/CH脂质体CCD－RSM法优化试验结果表

续表1

表2 Rg1/DPPC/ST脂质体CCD－RSM法优化试验结果表

采用Design－Expert 7．0软件处理数据，对Rg1/DPPC/CH脂质体，有:

直线回归方程为:Y=0．13078+0．035565X1－0.000143865X2+0．0150133X3(R2=0．6670，P＜0.01)

二次回归方程为:Y=0．25400+0．080565X1－0.0137274X2－ 0．0508121X3+0．0000491667X1X2+0.000330417

X1X3+0．0000728625X1X3－ 0．00590570X21－0.0000191762X22－ 0．00000335119X23(R2=0．8452，P＜0．05)

多元回归方程为:

Y=0．99929 － 0．069587X1－ 0．016878X2－0.012206X3+0．00396612X1X2+0．000381720X1X3+0．000250289X2X3－0．00354414X21－0．00000516883X22－0.00000335119X23－0.0000322594X1X2X3－0.000177039X21X2+0.000200623X21X3－0.00000254679X1X22(R2=0.9058，P＜0.05)

由以上方程可知，多元回归方程的拟合效果最好。采用OriginPro 8．0软件绘制三维效应面图，考察X1、X2、X3三个因素对Y的影响，如图4所示。

图4 Rg1/DPPC/CH脂质体效应面图

对Rg1/DPPC/ST脂质体，有:

直线回归方程为:Y=0．19373+0．028975X1+0.000496758X2+0．000789704X3(R2=0．6462，P＜0.01)

二次回归方程为:

Y=0．55264+0．043245X1－ 0．00258731X2－0.010223X3+0．000393333X1X2+0．000121667X1X3+0．0000285X2X3－ 0．00435332X21－ 0．0000036019X22+0．0000834881X23(R2=0．8392，P＜0．01)

多元回归方程为:

Y=0．59388+0．037897X1+0．00484306X2－0.020252X3－ 0．000782009X1X2+0．00165617X1X3+0．000189335X2X3－0．00470028X21－0．000119456X22+0．0000834881X23－0．0000292428X1X2X3－0.000028322X21X2+0．0000465899X21X3

+0．0000210645X1X22(R2=0．9354，P＜0．05)

由以上方程可知，多元回归方程的拟合效果最好。采用Origin Pro 8．0软件绘制三维效应面图，考察X1、X2、X3三个因素对Y的影响，如图5所示。

图5 Rg1/DPPC/ST脂质体效应面图

2．4 最优工艺验证

由CCD－RSM法优选Rg1/DPPC/CH脂质体的制备工艺条件为:X1=7．4 ～8．1%，X2=50．0 ～85．0min，X3=60．0 ～63．0℃;Rg1/DPPC/ST 脂质体的制备工艺条件为:X1=7．6 ～8．1%，X2=95．0 ～100．0min，X3=40．0～63．0℃。按优选工艺分别制备Rg1/DPPC/CH脂质体和Rg1/DPPC/CH脂质体各3批，依2．2．1项下方法测定其包封率，结果见表3，数学模型满足预测要求。

表3 脂质体包封率验证结果(n=3)

2．5 脂质体粒径分布测定与形态学考察

马尔文动态光散射粒径仪检测脂质体的粒径分布。激光束波长633nm，入射与散射光束夹角173°，温度25℃。取10μL脂质体溶液用纯净水稀释至1mL，混合均匀，置比色皿中测定。透射电镜观察脂质体的形态。脂质体适当稀释后，滴于300目铜网表面，加入2%磷钨酸溶液染色，染色完成后置透射电镜中观测。实验结果见图6～7。

图6 Rg1/DPPC/CH脂质体粒径分布与电镜图

图7 Rg1/DPPC/ST脂质体粒径分布与电镜图

由图6～7可知，薄膜分散法制备的Rg1/DPPC/CH和Rg1/DPPC/ST脂质体为多层脂质体，其圆整度较好，可以满足制备工艺要求。

3 讨论

ST是植物细胞膜中的主要甾醇，与CH的结构相似，有研究表明，ST对脂质体膜的稳定性要大于CH［6］，且能提高药物的生物利用度［7］。本实验同时制备Rg1/DPPC/CH脂质体和Rg1/DPPC/ST脂质体，并采用CCD－RSM法对脂质体制备工艺进行优化，结果表明，两种脂质体包封率相近，提示可以ST代替CH作为Rg1脂质体的膜材。

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