真菌Rab蛋白功能的研究进展

齐尧尧， 张冬梅， 周 洁， 鲁国东

(福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室， 福建 福州 350002)

Rab家族蛋白是小G蛋白Ras超家族最大的亚家族，普遍存在于真核生物中，分子质量大多在22-25 ku，在酵母、果蝇、小鼠和人类等各种真核生物中发挥着各种各样的功能。近年来，真菌 Rab 族蛋白的结构与功能研究成为小G蛋白研究的热点。Rab蛋白最早在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中发现，称为YPT/SEC蛋白。随后Touchot et al[1]从大鼠大脑cDNA文库中克隆到与YPT/SEC功能类似的同源物，并将其命名为Rab。根据Rab家族成员的同源性和功能相似性，可将Rab家族蛋白分成10个亚家族，即Rabl、Rab3、Rab4、Rab5、Rab6、Rab8、Rabll、Rab22、Rab27和Rab40[2-4]，其中真菌Rab家族中有Ypt1、Sec4、Ypt3、Ypt5、Ypt6、Ypt7、Ypt10、Ypt11、Ypt4和Ypt8等十几个亚家族。细胞学定位研究结果表明，Rab蛋白广泛分布于胞内各个细胞器的浆膜内侧，同一个细胞器可以有多个Rab蛋白，以维持蛋白转运的连续性和细胞器膜的完整性，其功能的发挥依赖于其在细胞中的定位[5]。真核生物的胞吞作用对于膜蛋白、膜脂的周转或清除，营养的摄入，膜受体蛋白的调控，细胞极性的维持以及抗原递呈等都具有重要意义。研究表明， Rab家族蛋白是迄今为止所发现的最为重要的转运相关蛋白，在真核生物胞吞过程的泡囊形成和运输中均起着重要的调节作用。

1 Rab蛋白的结构

真核生物的Rab蛋白作为一种单体形式的GTP结合蛋白，大约由200个氨基酸组成，能够结合GTP并将GTP水解。Rab蛋白具有一些共同的结构特征，即由保守的G结构域和高度可变的N端和C端组成。G结构域包含 5 个α螺旋(A12A5) 、 6 个β片层(B12B6)和5个多肽环(G12G5)，并与Mg2+相连。6个β片层形成疏水的核，与亲水的α螺旋和多肽环连接。5个多肽环中共有序列元件与 Mg2+、 GTP/ GDP发生相互作用。在G结构域中存在2个分子开关(switch I和switch II)，分别位于G2和G4-a2-G5，是Rab蛋白与其调控因子相互作用的位点[6]。研究表明，不同 Rab蛋白的分子开关区域相似，不仅结构特点相同而且分子开关 II 的构象保守[7-8]。

Rab 蛋白的 N 端和 C端在长度和序列上是高度可变的。Rab 蛋白 C 端均有 C、CC、 CXC或 CXXX模体(motif)，该模体是一种膜定位信号。当模体中的半胱氨酸异戊二烯化修饰后，Rab蛋白即通过 C端与膜相连。N端的作用可能是参与指导C端半胱氨酸进行异戊二烯化修饰。对Rab蛋白突变体及嵌合体的研究表明，分子开关 I和分子开关 II、高度可变的N 端和 C端是 Rab 蛋白重要功能的决定者。

2 真菌中Rab蛋白的种类

最新的人类基因组测序结果表明，人类至少有70个Rab蛋白[9]，广泛存在于各染色体。在酿酒酵母中，有11个Rabs/Ypts；秀丽短杆线虫有29个Rabs；黑腹果蝇中有29个Rabs；拟南芥中有57个Rabs。就某个Rab而言，在哺乳动物和酵母中功能是保守的[3]。

真核生物不同物种的细胞因物种的进化位置不同而表现某种程度的特化及专一性。Rab蛋白就是具有组织特异性和细胞器特异性的小G蛋白。这种定位特异性，甚至被认为是某种细胞器的标记。真菌中的一部分Rab蛋白和相应的真核祖先的大小相似，甚至略小。这说明营腐生生活的真菌，尽管由于菌丝多细胞性需要高强度的分泌活动，但是并没有进化出一套特殊的调节蛋白转运的分子机制。真菌中Rab/Ypt蛋白和其它与蛋白转运相关的蛋白家族一样，数目较少[10](图1)，而且其数量不是随基因组的增加而相应增加。表明在Rab蛋白中，真菌的多细胞性和细胞多样性遵循的进化途径与植物和动物不同。

图1中所列的是人和植物的常见病原真菌，26种真菌中有24种Rab家族成员的数目稳定在8-12个，而它们基因组大小差异很大，基因数2000-17000个。对酿酒酵母(S.cerevisiae)等真菌的研究表明，真菌Rab蛋白家族包含有Ypt1、Sec4、Ypt3、Ypt5、Ypt6、Ypt7、Ypt10、Ypt11、Ypt4、Ypt8、A、B和C等十几个亚家族。

稻瘟病菌基因组共有11 个假定的Rab 蛋白成员， 这些蛋白均含Ras超家族典型的结构域， 但具有可以区别于Cdc42 等Rho 家族小GTP 酶的特征， 部分Rab 成员表现出组织与时空表达的特异性。 进一步系统进化分析结果表明： 稻瘟病菌、白色念珠菌、粗糙脉孢菌等23 种真菌Rab 蛋白在进化树上聚成8 个分枝；Rab 蛋白的分化可能早于真菌种类的分化[11]。

A表示常见的真菌进化关系,B中每一栏表示1个Rab亚家族,C分别表示细胞分裂方式、分类和生活类型。 图1 真菌中Rab家族蛋白 Figure 1 The Rab protein family in fungi

3 真菌中Rab蛋白的功能

Ypt1、Sec4、Ypt3、Ypt5、Ypt6 和Ypt7亚家族为真菌中最常见的Rab家族，其定位[10]如图2所示。从图2可看出：Ypt1定位在内质网和顺面高尔基体膜囊，在分泌途径的早期发挥作用，介导内质网到高尔基体的运输；Ypt3及其同功蛋白Rab11参与深层次的胞吞作用[10]；Ypt5介导高尔基体-内涵体和质膜-内涵体运输。Ypt6参与高尔基体-内质网和高尔基体内的运输；Ypt7介导膜泡的融合；Sec4介导来源于顺面高尔基体网状膜囊的囊泡进入芽体，意味着其同功蛋白Rab8介导极性运输结构的形成[3，9]。

图2 真菌Rab蛋白的定位和功能Figure 2 The localization and function of the common set of fungi Rab protein

3.1 酵母Rab蛋白

Rab 蛋白最早由Novick et al[12]在酿酒酵母分泌系统研究中发现，它们是许多细胞正常分泌所必需的，并以SEC 系列命名(如SEC1 等) 。随后，Gallwitz et al[13]发现了YPT1 基因。酿酒酵母SEC4 基因和YPT1基因都参与细胞分泌活动。YPT1、SEC4和YPT7在胞内囊泡运输的不同阶段发挥作用[14]。酵母中的 Rab蛋白称为 Ypt蛋白 (Yeast protein transport) 。在目前已报道的基因组序列中，裂殖酵母 (S.pombe) 含有最少数量的 Rab蛋白基因，仅编码 7个 Rab蛋白，酿酒酵母Vam4/Ypt7p在同型囊泡融合过程中发挥着重要作用。酿酒酵母编码 11个 Rab蛋白， 其中Ypt1、Ypt31、Ypt32和Sec4是细胞生存所必需的，它们参与细胞的胞外分泌。有5种蛋白Ypt51、 Ypt52、Ypt53、Ypt6和Ypt7参与细胞的内吞过程，为非生存必需蛋白。其中Ypt6是内涵体到高尔基体之间膜蛋白循环所必需的[14]，Ypt10和Ypt11的功能目前还不清楚[15]。

酵母同型囊泡融合停泊需要Sec18p (NSF)引发。多亚基蛋白复合体Vam2/6p和位于单个囊泡膜上的SNAREs(SNAP receptors)，即v-SNARE的结合需要Ypt7p参与。Vam2/6p首先结合小G蛋白Ypt7p引发囊泡之间的多重联系；v-SNARE 复合体中Rab/Ypt效应子经NSF/Sec18p驱动，直接与Rab/Ypt蛋白结合，进而停泊[16]。

3.2 丝状真菌的Rab蛋白

构巢曲霉中Vam4/Ypt7p类似物AvaA的缺陷，引起空泡片段化撕裂，说明AvaA在囊泡形成过程中行使功能[17]。黑曲霉SEC4类似物SrgA的突变体，菌丝生长速度加倍，在以葡萄糖为碳源的培养基上蛋白分泌显著减少，说明SrgA虽具有生理功能，但不是黑曲霉生长所必需的[18]。

关于Rab蛋白及其效应因子在植物病原真菌中的作用已有一些研究。对Colletotrichumlindemuthianum的研究发现，Rab蛋白通过参与胞内分泌泡囊的运输、将相关蛋白运送至胞外以及分化侵染结构等一系列过程来调控该菌的致病性；而对Ustilagomaydis的研究发现，SNARE蛋白[19]YUP1与Rab5共定位于早期内涵体，其介导的胞吞作用对该菌致病的早期过程是至关重要的。

稻瘟病菌是水稻的重要病原真菌，也是丝状真菌研究的模式生物。研究表明，至少有2个信号途径及大量的基因参与调控稻瘟病菌的侵染致病过程。一是依赖于cAMP的蛋白激酶途径，二是MAP蛋白激酶级联机制。稻瘟病菌的侵染过程经历了分生孢子萌发、附着胞分化、侵入栓形成以及侵染生长等过程，涉及到复杂的蛋白修饰、信号转导和与转运相关的膜融合等生理活动。Fischer-Parton et al[20]借助荧光染料FM4-64，在显微镜下观察到包括稻瘟病菌在内的9种丝状真菌菌丝中的胞吞现象。Atkinson et al[21]对稻瘟病菌活细胞显微观察发现，胞吞作用贯穿于分生孢子萌发至侵染水稻的早期过程，暗示着胞吞作用与稻瘟病菌致病性存在相关性。因此，Rab家族蛋白介导的胞吞作用在稻瘟病菌侵染致病过程中可能发挥着重要作用。

4 展望

Rab家族蛋白是一类可能具有重要生物学功能的蛋白，随着对互作蛋白研究的不断深入，新的Rab蛋白及其效应因子不断被发现。Rab家族成员具有不同的功能，且不同的成员遍及细胞内各类细胞器及运输囊泡，以调节囊泡特定的运输途径。目前国内主要集中于对人和水稻中Rab蛋白基因的克隆、蛋白表达及功能的研究。深入了解真菌中Rab家族蛋白的功能，将有利于进一步揭示稻瘟病菌等植物病原真菌的致病机制，对于制定合理的防治策略具有重要的意义。

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