病原体调控宿主细胞周期致病机制的研究进展

李晨潇，黄新华，何思为，王德成

复旦大学上海医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海 200032

过去几十年中，人们在病原体与宿主相互作用的研究领域取得长足进展。病原体可通过多种途径存活，如阻止吞噬体与溶酶体的融合[1]、分泌多种分泌性因子抑制宿主呼吸爆发[2]、影响细胞骨架组装[3]或调控宿主细胞凋亡[4]。近年来，病原体通过调控宿主细胞周期致病的机制引起广泛关注，研究表明病原体感染后导致的细胞周期紊乱是疾病发生、发展过程中的重要环节。

研究病原体入侵对宿主细胞周期的影响，对理解病原体的致病策略和机制非常重要。本文就病原体入侵宿主后对宿主细胞周期的影响进行分类，阐述其作用机制，并概括宿主细胞周期紊乱后的可能结局及该结局在病原体致病中的作用。同样，宿主也可通过细胞周期采取一系列措施对抗病原体。系统阐明细胞周期在病原体致病中的作用，不仅有利于拓宽对病原体致病机制的认识，还能为传染病防治提供新的视角，对新药研制等也有潜在价值。

1 病原体调控细胞周期的机制

细胞周期是细胞从上次分裂结束到下次分裂结束经历的过程，包括4个时期：G1期、S期、G2期和M期。G1期为DNA合成前期，细胞不断生长。S期为DNA合成期，细胞从二倍DNA经过一次复制变成四倍DNA。G2期为DNA合成后期，合成一些必要的蛋白，为有丝分裂做准备。M期是细胞进行有丝分裂时期，染色体一分为二，分裂为2个子细胞。细胞再根据相应的信号，进入暂停分裂的静息期(G0期)，或者继续增殖、分化。

细胞周期的有序进行是在细胞本身和环境因素的严格控制下完成的。其中，最关键的3类调控因子是细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)、细胞分裂周期(cell division cycle，CDC)蛋白以及细胞周期素(cyclin)。这些调控因子构成复杂的网络，调控细胞周期主要事件。此外，细胞中还存在检测点(check point)，对细胞周期的运行严格监控。DNA损伤导致复制不完全或纺锤体形成异常，周期被阻断。只有当故障修复完成后，细胞周期才能继续进行。这些检测点包括未复制的DNA检测点、纺锤体组装检测点、染色体分离检测点、DNA损伤检测点[5]。从G1期到S期、G2期到M期是细胞周期调控的2个关键时期。一旦细胞周期失控，染色体发生异常，如缺失、重排等，则导致疾病发生[6]。研究表明，一些病原菌感染宿主细胞后，直接或间接影响其细胞周期，导致紊乱，进而改变宿主细胞分化、增殖等进程，最终有利于病原菌存活、繁殖[7]。

细胞周期是细胞的基本生活规律，一经启动便有序进行。它具有单向性、阶段性和时相性的特点。作为一个有序的活动，细胞周期活动中任何一点失误对细胞都是灾难性的。有结果表明，病原体调控宿主细胞周期以有利于自身增殖和(或)阻碍宿主细胞正常功能，这在致病过程中可能扮演重要角色。

1.1 G0/G1期

G1期内存在细胞周期检查点，即R点(restriction point)。细胞需通过检查点才能继续DNA合成，否则退回静息期。溃疡分枝杆菌(Mycobacteriaulcerans)感染后可导致皮肤和软组织广泛破坏。Small等[8]报道其分泌的毒力因子mycolactone能引起L929细胞周期受阻于G0/G1期。Lai等[9]首次报道用卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)感染培养的人支气管上皮细胞，诱导细胞周期停滞在G0/G1期，促进凋亡。Albrecht等[10]报道人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)感染人胚肺成纤维细胞，能阻止细胞DNA合成，停滞在G1晚期。HCMV可引起cyclin E/CDC2激酶高表达，激活核苷酸代谢及其他生物合成过程，为病毒复制提供有利条件。

1.2 G1/S期

Cyclin D1是G1/S期监控点重要的正向调控因子，其与CDK4/6形成激酶复合物，使细胞进入S期。 Shirin等[11]报道，幽门螺杆菌(Helcobacterpylori)感染胃癌AGS细胞系可通过上调周期蛋白抑制剂P27KIP1表达，使细胞周期停在G1/S期，并诱导凋亡。柯萨奇病毒B3(coxsackievirus B3，CVB3)是一种肠道病毒，感染后能使细胞周期停滞在G1/S期，这可能与cyclin D1泛素依赖的蛋白水解增加有关[12]。人疱疹病毒(human herpesvirus，HHV)可在宿主体内潜伏或持续感染。HHV-6B能引起宿主细胞G1/S期、G2/M期阻断[13,14]，该阻断与P53信号途径无关[15]。

1.3 G2/M期

所有真核细胞从G2期进入有丝分裂期需CDC2激酶的激活，而CDC2的激活部分受其上Tyr15磷酸化的控制。Tyr15在G2晚期被Wee1激酶磷酸化，并迅速被CDC25酪氨酸磷酸酶去磷酸化，使细胞进入M期。CDC2受G2/M期DNA损伤和DNA修复检查点的调控，一旦DNA受损或复制受阻，检查点可阻止细胞进入G2期并进行修复。病毒同样也可调控CDC2。由人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)编码的病毒蛋白R(viral protein R，Vpr)使细胞阻断在G2期，不通过DNA损伤检查点，阻止CDC2磷酸化，其中蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)发挥重要作用[16]。

值得注意的是，一些细菌可分泌Ⅲ型毒力因子注入宿主细胞，使有丝分裂延迟或将细胞周期阻断在G2/M期。邵峰等首先发现类鼻疽杆菌(Burkholderiapseudomallei)、肠道耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)等病原体的基因组可编码同源性肽类，这些多肽可通过与木瓜蛋白酶类似的催化活性将真核细胞周期阻断在G2/M期，并导致发病[17]。细胞致死性膨胀毒素(cytolethal distending toxin, CDT)具有DNase活性，可触发DNA损伤检查点，使细胞周期停滞在G2/M期[18,19]。与此相反的是，肠致病性大肠埃希菌(enteropathogenicEscherichiacoli, EPEC)和肠出血性大肠埃希菌(enterohemorrhagicEscherichiacoli, EHEC)分泌的周期抑制因子(cycle inhibiting factor, Cif)，可通过Ⅲ型分泌系统注入宿主细胞，不触发DNA损伤检查点，使细胞周期停滞在G2/M期[20]。但有研究报道，G2后期感染表达Cif的大肠埃希菌的细胞周期阻断在G1期，而非G2/M期[21]。此外，志贺菌(Shigella)通过Ⅲ型分泌系统分泌的蛋白因子IpaB直接与Mad2L2结合，后者是一种细胞周期后期促进复合物(anaphase-promoting complex/cyclosome, APC/C)的抑制剂，从而抑制有丝分裂后期启动复合物，引起有丝分裂延迟[22]。

综上所述，细胞周期中相邻时相的转换，细胞形态、结构等方面的改变，都是在细胞本身及环境因素严格控制下有序进行的。细胞中多种蛋白参与该调控。病原体可直接或间接作用于宿主细胞，调控细胞周期相关重要因子或检查点，多层次调控细胞周期。该调控呈宿主特异性和复杂性，由一些病原体分泌的毒力因子或编码产物通过其特有机制而进行调控(表1)。

表1病原体及其相关毒力因子/蛋白对宿主细胞周期的调控

Tab.1Modulationofhostcellcyclebypathogensandtheirproducts

PathogenVirulence determinantCell lineEffectMechanismReferenceBCG-Human airway epitheliumG0/G1 stage block-[9]Hepatitis C virusNS2 proteinMammalian cellS stage block Down-regulation the expression of cyclin A[23]Coxsackievirus B3-HeLa cellG1/S stage blockDegradation the activity of cyclin D1 ubiquitin proteinase[12]Epstein-Barr virusGenotoxinMammalian cellG2/M stage blockInactivate a G2/M check point[24]Helicobacter pylori-Human stomach cellG1/S stage blockHighly express P27KIP1 and inhibit the activity of cyclin E/CDK2[25]Human cytomegalovirusIE86 proteinHuman fibroblastG1/S stage blockRegulate the expressions of cyclin E and cyclin A[26]Human herpesvirus 6B-Human epitheliumG1/S stage block-[15]Mycobacteria ulceransMycolactoneMacrophageG0/G1 stage block-[27]

2 病原体调节细胞周期对其自身和宿主的影响

2.1 自我修复

细胞周期进程中有多个检查点：R点、S期检查点、G2/M期检查点和纺锤体组装检查点。病原体入侵后，这些检查点能监控周期进程中的异常事件。若DNA损伤或复制受阻，此调节机制激活，引起细胞周期改变，并修复损伤DNA。故障排除后，细胞周期才能恢复运转。Ferreira等用多种化学试剂使细胞同步化，感染腺病毒载体(adenovirus vector, AdV)，发现同步化到S期最有利AdV复制[28]。

2.2 凋亡

若DNA损伤，G1/S检查点也可诱导P53高表达。P53可引起多种基因转录，如细胞周期抑制蛋白P21(引起周期阻滞，阻止损伤DNA的复制)。若损伤严重，P53可激活Bax、Fas等，诱导细胞凋亡。感染早期引起的细胞凋亡可有效控制病原菌在体内传播。有些细菌通过干扰细胞周期阻止细胞凋亡，有利于在宿主体内生存、生长，而感染晚期引起宿主细胞凋亡。由于不完全吞噬，使一部分细菌在胞外繁殖，导致细菌引起新的感染。

2.3 增殖

如果监控机制不能发挥正常作用，细胞周期紊乱导致的受损DNA也能复制，细胞可无限增殖，从而发生癌变。细胞周期蛋白过表达、相应周期抑制蛋白(cell cycle inhibitor， CKI)表达异常或不足、检查点失常、原癌基因突变为癌基因、抑癌基因发生变异或丢失，都会引起细胞的异常增殖。有些病毒可引起细胞癌变，其通过自身癌基因编码产物——癌蛋白，直接作用于细胞，从而引起细胞恶性增殖。人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)能使P53介导的细胞对DNA损伤的正常反应失效，下调P21Waf1/Cip1，阻止细胞启动凋亡机制，引起细胞癌变、增殖[29,30]。

病原体入侵后，通过干扰宿主细胞周期，使感染细胞停滞在更适合自身生存的状态，充分利用细胞在不同周期的代谢产物，用于自身复制，造成体内持续感染。Schang等[31]报道，在非神经细胞的G1晚期至少有1种CDK是HSV转录、DNA复制所必需的。细胞周期抑制剂roscovitine和olomoucine使细胞周期停在G1/S晚期，HSV的DNA复制、即刻早期(immediately early，IE)基因或E基因的表达受抑制，而这些现象并非由药物诱导的细胞毒性引起。阿留申病细小病毒(Aleutian mink disease parvovirus, AMDV)可使宿主细胞停在S期，有利于病毒自身复制[32]。

此外，宿主细胞周期改变也可能是其在病原体入侵后采取的主动防御过程。处于不同周期状态的细胞对病原体本身的复制、激活也有很大影响。Feuer等[33,34]用CVB感染同步化的细胞，发现G0期的细胞感染后，病毒数目减少，推测G0期细胞不支持病毒复制。一旦此类细胞再进入细胞周期，病毒就能重新激活，引起宿主体内持续感染。另一方面也可能说明，处在不同时期的细胞对病原体的防御能力不尽相同。宿主细胞类型及细胞周期的状态差异也使其对病原体的反应不同。Lilley等[35]报道，用不同细胞如Vero和PC12细胞在表达糖脂类受体GM1和Gb3(细胞表面分别结合霍乱弧菌和志贺菌毒素的受体)时，都呈细胞周期依赖性调节作用。

3 结语

对细胞周期的研究促进人们对细胞损伤机制的认识，同时也为疾病诊断与治疗提供新策略，如一些CDK抑制剂、靶向周期蛋白药物等。近年来，病原体感染引起宿主细胞周期的改变受到广泛关注，正成为新的研究热点。一些病原体在入侵后，不会马上被杀死，而是潜伏在宿主细胞内，造成持续感染或潜伏感染。这可能与病原体干扰宿主细胞周期有关，使受损DNA通过检查点，抑制细胞启动凋亡机制，使细胞周期停留在特定时期以方便自身生长和繁殖。

大量研究显示，有些病毒感染机体后可调控宿主细胞染色质的修饰，造成DNA损伤，以利于病毒转录、复制，而在宿主体内持续存在。研究病毒调控宿主细胞周期，不仅为染色质在DNA修复中的作用提供了良好的研究模型，还为治疗介入开拓了新思路[35]。也有研究证实，有些细菌通过分泌细胞周期调节素干扰宿主细胞周期进程。随着越来越多新型周期调节素的发现和体内研究的深入，人们对细菌与宿主的共栖、共生、致病机制甚至肿瘤研究都获得了更全面的认识。本课题组研究的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)是结核病的致病菌，侵入机体后主要寄生在巨噬细胞中，造成长期潜伏感染。结核分枝杆菌形成的荚膜可抑制巨噬细胞吞噬体与溶酶体融合。当然细菌的致病作用并非孤立的事件，而是与宿主细胞复杂相互作用的结果。已有研究表明，BCG能使BAEpC细胞系的细胞周期停在G0/G1期，诱导细胞凋亡[9]。此外，越来越多的研究显示，结核分枝杆菌能调控宿主细胞的凋亡效应[36]，而细胞周期紊乱又与细胞凋亡的发生密切相关。因此，结核分枝杆菌作为典型的胞内菌，研究其对宿主细胞周期的调控可帮助揭示胞内菌的致病过程。

由于病原体入侵宿主并调控细胞周期是一个多因素、多环节的过程，且宿主本身体内不同细胞的细胞周期进程不尽相同，宿主细胞本身也有周期性细胞、G0细胞、终末分化细胞之分，因此细胞周期作为宿主的一个基本生命过程并非孤立，既受细胞所处微环境信号的影响，又依靠细胞内复杂的信号转导网络调控。病原体对宿主细胞周期的调控作用具有复杂性，不同研究可能因为细胞来源、研究方法、病原差异而有矛盾。对病原体调控宿主细胞周期研究的不断深入，不仅使人们对病原体的致病机制有更全面的认识，而且为新的药物靶点的设计和传染病的治疗提供新视角。

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