高效液相色谱法测定川东獐牙菜中獐牙菜苦苷的含量

蔡兴东，杨建平，黄 春，沈 力，李润琴，刘 丹，张乐星

(重庆三峡医药高等专科学校，重庆万州 404020)

高效液相色谱法测定川东獐牙菜中獐牙菜苦苷的含量

蔡兴东，杨建平，黄 春，沈 力，李润琴，刘 丹，张乐星

(重庆三峡医药高等专科学校，重庆万州 404020)

目的：建立川东獐牙菜中獐牙菜苦苷的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法，Crest C18（4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，流动相：甲醇-水（25∶75），流速：1 ml/min，检测波长：254 nm，柱温：25℃。结果：獐牙菜苦苷在0.4～2.0 μg范围内线性关系良好（r=0.999 9），平均回收率为99.78%，RSD=1.86%（n=6）。结论：该方法简便、准确，重现性好,可作为川东獐牙菜中獐牙菜苦苷的含量测定方法。

川东獐牙菜；獐牙菜苦苷；含量测定

川东獐牙菜（Swertia davidi Franch.）又名水灵芝、鱼胆草、青鱼胆草、水黄连，为龙胆科獐芽菜属植物川东獐牙菜的干燥全草。《四川省中药材标准》1987年版以鱼胆草名收载，具有清热解毒、利胆健胃等功效，民间常用于各种类型肝炎及胆囊炎等的治疗。有研究表明，川东獐牙菜的苦苷类成分有明显的抗肿瘤作用[1]，其提取物制成的注射剂对革兰阳性菌具有较强的抑制作用[2]。川东獐牙菜仅在长江上游及其乌江支流一带海拔130～170 m的河谷地带生长，三峡库区蓄水175 m后，失去自然生长条件成为濒危药用植物，有学者对其进行了生药学和引种栽培研究，现已实现人工种植[3-6]。川东獐牙菜具有广阔的开发利用前景，而其相关研究报道却不多，为进一步深入研究、开发利用川东獐牙菜，本实验采用高效液相色谱法对川东獐牙菜中的有效成分之一獐牙菜苦苷含量进行了测定，为川东獐牙菜的质量控制提供了参考。现将实验内容介绍如下：

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津 LC-2010A高效液相色谱仪，紫外检测器，BSA124S-CW型万分之一电子天平（德国赛多利斯）；MILLIQ BIOCEL超纯水机 （法国密理博公司）；KQ-250DA型数控超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

獐牙菜苦苷对照品（批号：09110401），购于成都普思生物科技有限公司（纯度＞98%）；川东獐牙菜药材，购于万州，经重庆三峡中药研究所沈力教授鉴定为龙胆科（Gentianaceae）獐牙菜属植物川东獐牙菜（Swertia davidi Franch.）；甲醇为色谱纯；水为超纯水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Crest C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；甲醇-水（25∶75）为流动相，流速为1 ml/min，检测波长为254 nm，柱温为25℃。

2.2 对照品溶液制备

取獐牙菜苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升含0.1 mg的溶液，经0.45 μm的滤膜过滤，即得。

2.3 供试品溶液制备

称取经干燥粉碎的川东獐牙菜样品约1.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，精密称定重量，超声处理50 min，放冷，补足甲醇量，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液1 ml，甲醇稀释至10 ml，即得。

2.4 系统适用性试验

分别取对照品溶液和供试品溶液以，按上述色谱条件进行试验，考察系统适用性。HPLC色谱图见图1。

2.5 线性关系考察

精密吸取獐牙菜苦苷对照品溶液4、8、12、20 μl，注入色谱仪，测定峰面积积分值。以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，计算得回归方程：Y=6 355.8X-1 689.8（r=0.999 9），獐牙菜苦苷的线性范围为0.4～2.0 μg。

2.6 稳定性试验

取对照品溶液在0、2、4、8、12、24、48 h分别进样测定，结果基本一致，RSD=1.08%，表明溶液在48 h内稳定。

2.7 精密度试验

按上述色谱条件取獐牙菜苦苷对照品溶液，连续进样5次，测定峰面积积分值，RSD=0.4%，表明精密度良好。

2.8 重现性试验

取同一批川东獐牙菜药材样品5份，精密称定，依法测定含量，RSD=1.63%（n=5）。表明重现性良好。

2.9 回收率试验

采用加样法，取同一供试品6份，精密加入獐牙菜苦苷对照品溶液，分别依法测定獐牙菜苦苷含量，计算回收率，结果见表1。

2.10 样品含量测定

参照供试品溶液制备项下要求，制备样品溶液，精密吸取对照品溶液和样品溶液各10 μl，分别注入液相色谱仪中，依法测定，按外标法计算獐牙菜苦苷含量。3批样品中獐牙菜苦苷含量的测定结果见表2。

表1 獐牙菜苦苷回收率试验（n=6）Tab.1 Recovery test of Swertiamarin（n=6）

表2 样品含量测定结果（n=3）Tab.2 Content determination results of samples（n=3）

3 讨论

3.1 流动相选择

实验中曾参照文献[7]采用甲醇-水（20∶80）为流动相，獐牙菜苦苷保留时间较长，约26 min，调整流动相比例至甲醇-水为25∶75，獐牙菜苦苷于14.5 min左右出峰，与其他成分达基线分离，分离度大于1.5，且峰形对称尖锐。

3.2 提取条件的选择

獐牙菜苦苷易溶于甲醇，因此采用甲醇作提取溶剂。实验中参照文献[7-8]选取了超声提取法对川东獐牙菜药材样品中的獐牙菜苦苷进行提取，实验中分别在30、40、50、60 min考察了超声提取时间对獐牙菜苦苷含量的影响，结果表明超声处理50 min后提取液中獐牙菜苦苷含量不再增加，表明50 min已提取完全。

本实验采用高效液相色谱法，对川东獐牙菜中獐牙菜苦苷进行含量测定，从实验结果可以看出，供试品中獐牙菜苦苷得到了较好的分离，且无干扰；并经方法学考察，本法简便、准确、重复性好，可以为川东獐牙菜的质量控制提供参考，为进一步开发利用川东獐牙菜打下基础。

[1]赵李剑,左泽乘,邹洪波,等.川东獐牙菜苦苷类成分的提取及体外抗肿瘤作用研究[J].中医药导报,2006,12(5):62-64.

[2]刘士寻.川东獐牙菜对几种菌株的抑制试验[J].甘肃畜牧兽医,2003,33 (3):18-19.

[3]付绍智,余甘霖,沈力.川东獐牙菜繁殖方法比较[J].中药材,2002,25(9): 622-623.

[4]涂建雄.川东獐牙菜的生药学研究[J].湖南中医药导报,1999,5(12):12.

[5]黄衡宇,李鹂,陈义光.川东獐牙菜的引种栽培研究[J].武汉植物学研究,2002,20(2):145-149.

[6]李涛,曹玉娟,赵敏慧.川东獐牙菜引种栽培研究[J].玉溪师范学院学报,2006,22(9):94-98.

[7]胥秀英,唐春红,郑一敏,等.高效液相色谱法测定川东獐牙菜中獐牙菜苦苷的含量[J].中国药科大学学报,2003,34(5):475-476.

[8]夏从龙,刘光明,王胤.高效液相色谱法测定丽江獐牙菜中4种有效成分的含量[J].中国医院药学杂志,2007,27(5):598-601.

Determination of Swertiamarin in Swertia davidi Franch.by HPLC

CAI Xingdong,YANG Jianping,HUANG Chun,SHEN Li,LI Runqin,LIU Dan,ZHANG Lexing
(Chongqing Three Gorges Medicine School,Wanzhou 404020，China)

Objective:To establish a method for the determination of Swer-tiamarin in Swertia davidi Franch.by HPLC.Methods:High performance liquid chromatography was performed on C18column.The chromatographic conditions were as follows:methyl alcohol-water(25∶75)as mobile phase，flow rate being 1.0 ml/min,the detecting wavelength at 254 nm and column temperature being 25℃.Results:Swertiamarin had good linear relation within the range from 0.4 to 2.0 μg (r= 0.999 9).The average recovery was 99.78%with a RSD of 1.86%(n=6).Conclusion:This method is convenient,accurate, reproducible,and can be used for content determinaton of Swertiamarin in Swertia davidi Franch..

Swertia davidi Franch.;Swertiamarin;Content determination

R284.1

A

1673-7210（2011）02（b）-042-02

重庆市教育委员会科学技术研究项目资助（No：KJ082102）。

蔡兴东（1977.9-），四川资中人，硕士学历，讲师，研究方向为天然药物研究。

杨建平（1955.10-），重庆忠县人，病理学教授。

2010-12-14）