贵阳地区幽门螺杆菌临床分离株中ureA、cagA、vacA、iceA基因的分布及分析＊

王 菲，康沛萍，吴晓娟，陈峥宏

贵阳地区幽门螺杆菌临床分离株中ureA、cagA、vacA、iceA基因的分布及分析＊

王 菲，康沛萍，吴晓娟，陈峥宏

目的了解贵阳地区临床分离的幽门螺杆菌（Hp）的毒力基因ureA、cag A、vac A、iceA的分布特征，探讨不同毒力基因型与上消化道疾病的关系。方法用特异的16S rDNA聚合酶链反应进行临床分离Hp的菌种鉴定，对经过鉴定的152株幽门螺杆菌进行ureA、cag A、vac A、iceA基因及亚型的PCR检测。结果ureA基因的检出率为100%（152／152），vac A基因的检出率为100%（152／152），vac A 基因亚型以s1a－m2型为主，占76．3%（116／152），cag A 基因检出率为39．5%（60／152），ieeA1基因检出率36．8% （56／152），iceA2基因检出率为34．2%（52／152），13．2%（20／152）的菌株iceA1和iceA2基因均阳性，不同基因型菌株在慢性胃炎和消化性溃疡中的检出率无统计学意义（P＞0．05）。结论贵阳地区幽门螺杆菌毒力基因vac A以s1a－m2型为主，cag A阴性比例高于cag A阳性，不同基因型菌株与消化性疾病间无明显相关性。

幽门螺杆菌；毒力基因；上消化道疾病

幽门螺杆菌（Hp）是慢性活动性胃炎的病原菌，消化性溃疡和胃MALT淋巴瘤的重要致病因子，与胃癌的发生密切相关。Hp感染人群大多无症状，只有少数人可表现不同程度的症状，目前认为与宿主易感性、环境因素及Hp菌株的毒力差异相关［1］。Hp的毒力基因为vac A、cag A 和ice A［2］。空泡毒素基因（vac A）编码产生空泡毒素（Vac A），可引起胃粘膜上皮细胞损伤。vac A结构复杂，主要由信号序列（s区）和中间区域（m区）两个可变区组成。信号序列将HP分为sla、slb、s2三种基因型，中间区域分为m1、m2基因型。研究表明，不同Hp菌株的vac A基因型致病能力存在差异。cag A基因编码细胞毒素相关蛋白A，cag A致病岛是Hp引起胃肠疾病的主要因素。携带接触诱导基因（ice A）的Hp菌株与消化性溃疡和胃粘膜IL－8水平显著相关。尿素酶是尿素酶基因的编码产物，其中ureA为结构基因，尿素酶能使Hp定植于胃粘膜上皮细胞，是Hp感染的首要因素。本研究采用PCR方法对贵阳地区分离的Hp临床菌株进行了ureA、cag A、vac A和iceA基因型检测，以了解贵阳地区Hp的优势基因型及与不同疾病的关系。

1 材料与方法

1．1 材料 哥伦比亚琼脂、幽门螺杆菌选择添加剂，购于北京友康基业生物技术公司；厌氧罐，微需氧产气袋购自日本三菱化学株式会社，DP302－02柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、Hp16S r RNA引物、cag A引物、vac A及亚型引物、ure A引物 、ice A引物和2×Taq PCR Master Mix，均购自北京天根生物工程有限公司。

1．2 患者标本 共选取贵阳市第一人民医院经内镜或手术病理证实慢性胃炎（CG）187例、消化性溃疡（PU）92例和胃癌（GC）24例患者胃粘膜组织标本。

1．3 Hp菌株的分离和培养 用灭菌小剪刀剪碎，接种于哥伦比亚血琼脂培养基上，用L型玻棒将组织均匀涂布于培养基，置37℃微需氧环境中培养4 d，挑取可疑菌落增菌，获得180株Hp疑似菌株。

1．4 Hp临床分离菌株的鉴定 可疑细菌经革兰氏染色形态学、尿素酶试验鉴定后，采用DP302－02柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒，分别提取180株菌株的总DNA，以此作为模板，进行Hp菌种特异性16S r DNA的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测对其进行［3］。

1．5 Hp 菌株的ure A、cag A 、vac A、iceA 基因及亚型检测 参考文献［4］合成 Hp的ure A、cag A、iceA和vac A基因的引物。以经形态学、尿素酶试验和16S r DNA鉴定为Hp的临床菌株的总DNA作为模版，分别采用相应引物进行PCR扩增。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1．6 统计学分析 用SPSS11．5软件，采用χ2检验，对基因分型结果及与不同疾病的关系进行统计学分析处理。

2 结 果

2．1 Hp菌株的鉴定 303例胃粘膜标本共分离出180株革兰染色阴性螺旋状或弯曲杆状，尿素酶试验阳性的菌株，经过16S r DNA的PCR检测鉴定，其中152株为阳性，确定为Hp。

2．2 Hp临床分离株的ure A、cag A 、vac A、ice A 基因分布：所有152例患者感染的Hp－DNA标本共检出ure A阳性152份，阳性率100%；vac A阳性152份，阳性率100%，vac Asla基因型为94．1%（143／152），vac Aslb 基因型为5．9%（9／152），vac Am1基因型占15．8%（24／152），vac Am2基因型占81．6%（124／152），另有2．6%（4／152）的菌株不能用vac Aml和vac Am2分型。vac Asla－m2组合的基因型占76．3%（116／152），vac Asla－m1组合的基因型为15．8%（24／152），vac Aslb－m2组合的基因型为5．3%（8／152），另有4株信号序列为s1a，但中间区域不能分型。全部菌株中不存在s2基因型。vac As1a－m2型明显多于其他型别（P＜0．05）。cag A基因阳性60份，阳性率为39．5%。56例（36．8%）为ice A1型，52例（34．2%）为ice A2型，其中20例为iceA1和iceA2混合型，24例为iceA阴性。

2．3 不同基因型与疾病的相关性 表1中可见，vac A基因中s1a型多于s1b型，m2型明显多于m1型（P＜0．01）。vac Asla－m2组合在慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌组Hp中阳性率分别为85．2%，77．4%，72．7%；cag A 的 阳 性 率 分 别 为37．5%，39．6%，54．5%；iceA1 型 的 阳 性 率 为 35．2%，37．7%，45．5%；ice A2 型 的 阳 性 率 为 34．1%，33．9%，36．4%；不同vac A 亚型与慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌间未见明显相关性（P＞0．05）；而ureA、cag A、iceA基因在不同临床疾病间无统计学差异（P＞0．05）。

表1 152株临床分离的Hp ureA、cag A、vacA、iceA在各疾病组的分布（株（%））Table 1 Status of ureA，cag A，vacA and iceA gene in patients with CG，PU and GC

3 讨 论

在幽门螺杆菌的致病机制中，vac A和cag A是公认的两种重要毒力基因。研究表明［5］vac A和cag A联系紧密，在结构和功能上又相互独立的毒力因子，决定着Hp毒力的高低，vac A（＋）和cag A（＋）的Hp存在致病的协同性，可加重胃粘膜炎症和胃粘膜上皮细胞的恶化。所有的Hp菌株均含有vac A基因，但只有50%的Hp表达有空泡毒性蛋白。不同的vac A基因型别其分泌的空泡毒素在活性和量上有很大的差异。vac Asla－ml型菌株分泌的毒素活性最强，其次是s1a－m2型菌株。sla型菌株与高水平的空泡毒素活性、胃粘膜炎症和消化性溃疡密切相关。slb型菌株具有中等强度的致溃疡活性，而且slb型Vac A在体外较sla型Vac A具有较弱的细胞毒活性。cag A基因表达细胞毒素相关蛋白，普遍认为携带cag A基因是Hp毒力较强的标志。携带接触诱导基因（iceA）被认为是Hp菌株的又一毒力基因，携带有ice A的Hp菌株与消化性溃疡显著相关。iceA存在两个基因变异体iceA 1和ice A2。

Hp基因型流行病学状况在世界范围内存在地理差异性，地区间的差异和相似可能提示Hp的流行趋势、传播方向和来源［6］。我国上海的研究发现当地vac A基因型均为s1a－m2型，广东地区则以s1a－m2型为主。Hp菌株的cag A基因检出率在西方国家约60%，而日本、中国等亚太国家分离的Hp菌株cag A 基因检出率可高达90%。iceA1和ice A2的单独检出率在各地报道中差异很大，我国同其他东南亚地区以iceA1型感染为主。

本研究通过对贵阳地区分离的Hp菌株进行了ureA、cag A 、vac A、iceA 基因检测，结果见：Hp ure A基因检出率为100%；Hp vac A基因分型有s1a－m2型，s1a－m1型，s1b－m2型，没有发现s2型，其中s1a－m 2型为最主要的优势基因型，占76．3%，这与中国各地的报道一致，在本研究中有4株Hp菌株vac Am区基因PCR扩增阴性，不能用m1和m2分型，其他文献亦有报道［7］，是否出现变异或其他新的分型，需要进一步试验验证；cag A基因的检测阳性率为39．5%，远低于国内外文献报道数值，结果表明cag A阴性菌株亦可引起消化系统病变，但ca－g A的存在是否与胃粘膜病变的严重程度相关有待进一步证实；ice A1基因单独检出率36．8%，ice A2基因单独检出率为34．2%，两基因型的分布未见显著差异。

结果说明Hp的毒力基因在贵阳地区的流行分布有自己的特点，以cag A阴性，vac A s1a－m2型为主。未发现基因型与慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌间存在相关性。

［1］Rad R，Dossumbekova A，Neu B，et al．Cytokine gene polymorphisms influence mucosal cytokine expression，gastric inflammation，and host specific colonisation during Helicobacter pylori infection［J］．Gut，2004，53（8）：1082－1089．

［2］Gonzalez CA，Pena S，Capella G．Clinical usefulness of virulence factors of Helicobacter pylori as predictors of the outcomes of infection．What is the evidence［J］．Scandinavian Journal of Gastroenterology，2003，38（9）：905－915．

［3］吴晓娟，陈峥宏，王菲．PCR扩增16Sr DNA在幽门螺杆菌感染诊断中的运用［J］．现代检验医学杂志．2010，25（5）：76－78．

［4］Van Doorn LJ，Figueiredo C，Sanna R，et al．Clinical relevance of the cag A，vac A and ice A status of Helicobacter pylori［J］．Gastroentrology，1998，115（1）：58－66．

［5］Salih BA．The role of the putative virulence markers（cag A and vac A）of Helicobacter pylori in peptic disease［J］．Saudi Med J，2004，25（7）：830－836．

［6］Atherton JC，Peek RM Jr，Tham KT，et al．Clinical and pathological importance of heterogeneity in vac A，the vacuolating cytotoxin gene of Helicobacter pylori［J］．Gastroenterology，1997，112（1）：92－99．

［7］孙剑刚，张正茂，田拥军，等．湖北地区幽门螺杆菌vac A基因分型及疾病相关性分析［J］．山东医药，2006，46（31）：11－12．

Helicobacter pylori ureA，cag A，vacA and iceA status of Guiyang area and relationship to clinical outcomes

WANG Fei，KANG Pei－ping，WU Xiao－juan，CHEN Zhen－hong
（Guiyang Medical College，Guiyang 550004，China）

In order to study the distribution of vac A subtype and cag A，ureA and iceA gene of Helicobacter pylori（Hp）as well as the relationship between the presence of specific genotypes and upper gastrointestinal disease in Guiyang area，the Hp strains were isolated from the gastric mucous membrane tissue，and identified by PCR of 16sr DNA．Gene cag A、ureA、iceA and gene vac A subtypes of 152 Hp strains were typed using PCR with specific primers．Among 152 Hp－positive samples，the prevalence of ureA and vac A were 100%．It was primarily s1a－m2 in Guiyang area．The prevalence of iceA1 was 36．8%，ice A2 was 34．2%，iceA1 and iceA2 were both found in 13．2%．Results indicated that upper gastrointestinal diseases infection with Hp strains of vac A s1a－m2 subtype dominate in Guiyang area．

Helicobacter pylori；vac A；cag A；ureA ；iceA ；upper gastrointestinal disease

R378．99

A

1002－2694（2011）10－0918－03

＊贵州省科技厅基金资助项目（黔科合J字［2009］2086号）

陈峥宏，Email：czh009219＠gmc．edu．cn

贵阳医学院微生物学教研室，贵阳 550004

2011－05－17；

2011－07－09