凝胶上蛋白质染色方法研究进展

周旋，倪茂巍，陈茂，朱忠欣，丛维涛，金利泰

凝胶电泳是分离蛋.白质及多肽的一种强有力的生化分析工具。而蛋白质染色在凝胶电泳系统中则是一个重要的组成部分，随着蛋白质组学的飞速发展，凝胶蛋白质染色技术已成为衔接二维电泳和下游质谱分析的关键环节。目前，常用的凝胶上蛋白质染色方法主要有染料染色法、银染法、负染法和荧光染色法。本文对近几十年来在凝胶上蛋白质染色技术方面所取得的进展和突破进行总结，并对未来的发展方向做出展望。

1 染料染色法

1.1 考马斯亮蓝染色法

由于考马斯亮蓝（CBBR 和 CBBG）具有成本低、操作便捷及质谱兼容性好等特点，使得该类染料成为最常用的蛋白质染色染料。考马斯染料最初是应用于纺织工业中羊毛的染色，Fazekas 等[1]在 1963 年首次将考马斯亮蓝 R-250应用于聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到醋酸纤维素膜上蛋白质的染色，取得了较好的效果。随即，考马斯亮蓝 R-250和它的二甲基化衍生物考马斯亮蓝 G-250 又被应用于聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质染色[2]。在接下来的 20 多年中，不断有研究者针对蛋白质的考马斯亮蓝染色方法进行优化，各项技术指标如灵敏度、染色时间和凝胶背景都有一定程度的改善，但总体染色灵敏度还是较低，约为几百纳克到几微克，染色时间较长，且凝胶背景偏深[3-4]。

Neuhoff 等[5]开发的胶体考马斯亮蓝染色法，使考马斯亮蓝在染色液中形成胶束，从而有效提高了染色灵敏度，降低了凝胶背景，是考马斯亮蓝染色法优化史上具有重大意义的改进，通过该方法得到的染色灵敏度可以和银染相媲美。Candiano 等[6]发明的“Blue Silver”考马斯亮蓝染色法是该类染色法中的又一大进步，其灵敏度可达 2 ng/band。Pink等[7]在前人研究的基础上，最近开发出了一种高灵敏和质谱兼容性好的新型考马斯亮蓝染色法，通过改变染色液中磷酸的浓度，使得灵敏度达到 2 ng/band，同时质谱兼容性也得到了很大提高。虽然考马斯亮蓝蛋白质染色的原理尚未完全确定，但其可能机理主要为：考马斯亮蓝是二磺酸化的三苯甲烷类染料，其可通过染料的磺酸基和蛋白质上质子化的碱性氨基酸间以静电力相结合。其次，还可通过染料的疏水性残基和蛋白质的疏水性区域的作用产生疏水性力，同时也存在氢键和范德华力的作用[5]。

1.2 离子对染料染色法

在蛋白质染料染色的研究过程中，特别要指出的是离子对染色技术的提出，此项技术是蛋白质染料染色法理论上的一大创新。该方法分别选用一阴离子染料和一阳离子染料同时做为蛋白质的染色染料。在染色液中，由于阴阳离子相互结合作用，使部分染料以阴阳离子对形式存在，而离子对染料和游离的染料分子之间存在一个动态平衡，较大程度降低了染色液中游离染料的浓度，提高了游离染料分子和蛋白质的结合效率，降低凝胶背景，从而提高了染色灵敏度（图 1）。阴离子染料通过自身的磺酸基和蛋白质链上质子化的氨基酸结合，而阳离子染料主要是通过与蛋白质链上的带负电荷的羧基相结合实现染色。前期 Jin 及其研究团队在蛋白质离子对染色法的探索中做了大量的研究工作，如应用0.003% 的阳离子染料乙基紫（ethyl violet，EV）和 0.004%阴离子染料巯氧吡啶锌（zincon，ZC）组成 EZ 离子对染色液，在 1 h 内即可完成染色操作，其灵敏度达 2 ～ 8 ng/band，高于现有的考马斯亮蓝染色法数倍[8-9]（图 2）。同时，EZ染色法具有较浅的凝胶染色背景和优良的质谱兼容性，操作便捷，成本低，可较好地应用于各类实验室的研究中。

图 1 离子对检测技术的推测机理图

1.3 其他染料染色法

除考马斯亮蓝染色法外，Gorovsky 等[10]发现碱性孔雀绿对极端碱性的蛋白质如组蛋白等有较好的染色效果。Hong 等[11]将钙指示剂应用于凝胶上的蛋白质染色，钙指示剂即可以加入到电泳液中使得蛋白质在电泳的过程得到染色，电泳结束后就可直接观察蛋白质条带，灵敏度达25 ng/band；同时也可以采用传统的凝胶后染方法，即电泳结束后，再用染色液对凝胶染色，其灵敏度达 10 ng/band，超过考马斯亮蓝染色法的灵敏度。Jin 等[12]发现钙指示剂和银染法相结合可以提高蛋白质银染法的灵敏度并增加银染的质谱兼容性。

图 2 EZ 染色法（A）与胶体考马斯亮蓝染色法（B）灵敏度比较图

2 银染法

银染法主要是通过银离子渗透进入凝胶内与蛋白质结合，再用还原剂将与蛋白质相结合的银离子还原为金属银，从而达到检测蛋白质的目的。银染法的原理如下：在溶液条件下银离子能与蛋白质的天冬氨酸和谷氨酸上的羧基通过静电力相结合；同时银离子还可与组氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和赖氨酸上的咪唑、巯基、甲硫基和氨基结合。而与蛋白质结合的银离子可在甲醛等还原剂的还原作用下变为黑褐色的金属银使蛋白质显色。热力学研究表明：胶表面结合或残留的银离子比与蛋白质结合的银离子更容易被还原为金属银，造成凝胶上蛋白质的负染现象，但一般在凝胶显影之前会有水洗步骤，可将胶面上未与蛋白质结合的银离子尽可能的洗脱掉。因此，蛋白质银染的重现性和背景的深浅很大程度上取决于显影前的水洗步骤，如：水洗时间过长会使银染灵敏度低，水洗时间不足会造成凝胶背景加深。

根据银染时溶液条件的不同，蛋白质银染法可分为酸性银染法和碱性银染法即银氨法，酸性银染法通常是将中性硝酸银水溶液染色后的凝胶放在含甲醛的强碱性碳酸盐类显影液中显影，而碱性银染法一般是指将凝胶放在银氨溶液中染色接着用含甲醛的柠檬酸液显影。这两种银染法各有优缺点，如：酸性银染法比碱性银染法操作相对简单，但灵敏度没有碱性银染法高。虽然在所有染色方法中，银染法的灵敏度是最高的，但其缺点也很明显，如耗时长、步骤繁多、线性范围小和质谱兼容性差等。围绕银染法的不足，科研工作者对该方法进行了不断的改进，尤其是如何改进蛋白质银染法的质谱兼容性已成为当前研究的热点。银染中醛类还原剂能与蛋白质以共价键结合，使蛋白质甲基化，造成蛋白质下游研究的质谱兼容性降低。Shevchenko 等[13]用醇和酸的溶液代替以往醛类对蛋白质进行固定，虽然灵敏度有一定的降低，但蛋白质经银染后的质谱兼容性得到了提高。Jin等[12,14]首先采用染料离子如钙红指示剂和铬黑 T 作为银染增敏剂，以减少显影液里甲醛的用量，使得蛋白质鉴定时质谱兼容性得到大幅提高。Chevallet 等[15]发明的用还原糖代替甲醛的银染方法也取得了较好的灵敏度与质谱兼容性。

Jin 等[9]还在前人研究基础上创建了 EZ-银染双重染色法，即用阴阳染料离子对完成第一步染料染色，灵敏度为2 ～ 8 ng/band，根据实验需要可选择性地进一步进行银染，灵敏度可达 0.05 ～ 0.2 ng/band，为目前最灵敏的蛋白质银染法（图 3）。由于染料分子中含偶氮键，在银离子还原中可起到增敏的作用，因此降低了甲醛的使用量，增加了银染法的质谱兼容性（图 4）。

图 3 EZ-银染法（A）与戊二醛银染法（B）灵敏度比较图

3 负染法

蛋白质负染法的原理主要是：将金属离子有选择地沉淀在胶面上，而蛋白质条带不被染色。因此，蛋白质所处区域是透明的，从而达到检测目的。这种方法操作便捷，成本较低，但是该方法的对比度较差，且重现性受诸多因素的影响，因此限制了本方法的广泛使用。相关文献报道了许多蛋白质负染方法，主要包括氯化钾负染法、氯化铜负染法、氯化锌负染法、醋酸盐负染法、氯化镍负染法和锌咪唑负染法[16-18]等，锌咪唑负染是灵敏度最高的负染方法。锌咪唑负染的机理如下：在染色过程中，锌离子能与被 SDS（sodium dodecyl sulfate）包裹的蛋白质相结合，而在凝胶表面剩余的锌离子则会与咪唑形成沉淀，从而达到负染效果和检测目的[19]。在锌咪唑负染中，蛋白质与锌和咪唑的结合是可以逆转的，洗脱后的蛋白质化学性质没有改变，从而具有良好的质谱兼容性，因此锌咪唑负染法有望较好地应用于蛋白质组学的研究[20]。

图 4 EZ-silver 双重银染法中染料促进银离子还原的推测机理

4 荧光法

在蛋白质组学研究中，凝胶上的蛋白质荧光检测法正在逐渐成为研究的热点。研究结果显示，蛋白质荧光检测法具有线性范围广、灵敏度高（1 ～ 100 ng/band）、质谱兼容性好等优点，比较适合高通量蛋白质组学的研究。

尼罗红是一种较早应用于蛋白质染色的荧光染料，它的检测灵敏度为 20 ～ 100 ng/band，比考马斯亮蓝灵敏度稍高，且质谱兼容性较好[21]。但尼罗红荧光检测法的缺点主要表现为检测结果不稳定，在水溶液中尼罗红易形成沉淀，且光稳定性差，相对于其他商品化的蛋白质荧光检测试剂，其操作显得比较困难。

最近 SYPRO 系列荧光染料被广泛应用于凝胶上蛋白质的检测，如 SYPRO Red、SYPRO Orange、SYPRO Tangerine 等，其操作简单，可在 30 ～ 60 min 内完成染色操作，灵敏度达到 4 ～ 8 ng/band，同快速银染或胶体考马斯亮蓝染色法灵敏度几乎一致[22-24]。这三种荧光染料染色后的凝胶可置于紫外仪下，用 300 nm 激发光激发，拍照采集数据即可，同时还可以应用 CCD-图像分析工作站采集实验数据并分析。

SYPRO Ruby 是目前蛋白质组学研究中应用最广泛的一种荧光染料，灵敏度较上述三种 SYPRO 系列染料高，介于考马斯亮蓝染色法和银染法之间。且 SYPRO Ruby 有较广的线性范围和良好的质谱兼容性，有时甚至可以检测到银染法所检测不到的蛋白质。实验结果表明，SYPRO Ruby在检测表皮角蛋白时灵敏度是酸性银染法的 20 倍，是碱性银染法的 8 倍[25]。SYPRO Ruby 染料结构中含有螯合钌离子，使 SYPRO Ruby 上更多的磺酸基可以与质子化的蛋白质相结合，其灵敏度得到进一步的提高[26]。

Mackintosh 等[27]在真菌中发现化合物 Epicocconone并将其应用于凝胶上蛋白质的荧光染色，其灵敏度比SYPRO Ruby 还高出数倍，Amersham Biosciences 公司将它开发成商品化的试剂盒，命名为 Deep Purple。Deep Purple荧光染色原理如下：Epicocconone 在溶液中本身不发荧光，其荧光产生主要是染料通过疏水性力与 SDS 包裹的蛋白质上的赖氨酸作用，其荧光可得到极大增强[28]。

但由于 SYPRO Ruby 和 Deep Purple 等试剂盒价格昂贵，蛋白质荧光染色方法的研究工作一直在不断探索更加优良易得的检测方法。如 Cong 等[29]开发的 Palmatine 荧光染色法，灵敏度达 2 ～ 4 ng/band，并对原有的 BisANS 蛋白质荧光染色法进行改进，将其灵敏度提高达 1 ～ 2 ng/band[30]。这两种蛋白质荧光染色方法染色成本较低，操作简单，灵敏度接近 SYPRO Ruby，可较好地应用于高通量蛋白质组学的研究。

5 小结

综上所述，目前围绕染色方法的改进主要集中在如何提高染色灵敏度，操作是否简捷，成本是否低廉及操作是否安全等方面。上述各类方法经几十年的发展虽都取得了一定的进展，但还是存在许多不足之处有待于改进。例如：①染料染色法虽操作简单，质谱兼容性良好，但灵敏度还需提高；②银染法仍然是目前最灵敏的染色方法，但其质谱兼容性差和操作步骤繁琐的问题有待改善；③荧光染色法灵敏度介于银染和染料染色法之间，虽在蛋白质组学研究中具有较大的优势，但寻找更加稳定、灵敏、安全的荧光染料，缩短操作时间仍是荧光染色法所需要解决的问题；④负染法可以较好地克服上述诸多缺点，但其主要缺点是对比度有待提高。以上几点将成为未来几年内染色方法学需要解决的问题，这些方面问题的顺利解决，将会对蛋白质染色方法的进展产生重大影响。

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