固本活血壮骨颗粒对去卵巢大鼠血清IGF-1和IL-1β影响的实验研究＊

田丙坤，邢玉瑞△，张 丹

(1.陕西中医学院，陕西 咸 阳 712046;2.陕西中医学院2007级硕士研究生)

骨质疏松症相当于中医学骨痿、腰痛、骨痹、骨折、虚劳等范畴。早在上世纪90年代，我们即提出骨质疏松症的主要病机为肾虚、脾虚与血瘀，因而确立了补肾健脾活血为本病的治疗大法[1，2]，创制了固本活血壮骨颗粒。经初步研究临床疗效显著，且实验表明，固本活血壮骨颗粒能够有效提高去卵巢大鼠的骨密度，防治骨质疏松症[3、4]。为进一步深入探讨固本活血壮骨颗粒作用的微观机制，本实验拟以成骨细胞增殖强刺激因子胰岛素样生长因子1(IGF-1)和破骨细胞强刺激因子白介素1β(IL-1β)为指标，并结合上卵巢大鼠骨形态学改变，观察固本活血壮骨颗粒对其影响。

1 材料

1.1 动物

SPF级3月龄雌性SD大鼠60只，体重250g±20g，购自西安交通大学医学院实验动物中心，动物许可证号2007-001。

1.2 药物

固本活血壮骨颗粒(主要由淫羊藿、杜仲、鹿角胶、黄芪等组成)，由陕西中医学院中药制剂研究室生产，每1g含生药2g。大鼠给药量按文献方法折算[5]，用蒸馏水将药物配成每毫升含生药0.2g(小剂量)、1g(大剂量)(大小剂量为 1 ∶5)混恳液，置4℃冰箱中备用。尼尔雌醇片(批准号国药准字H11020123，北京四环制药有限公司)，用蒸馏水配成0.1g/ml混悬液备用。仙灵骨葆胶囊(成分:淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄。批准号国药准字Z20025337，贵州同济堂制药有限公司)，用蒸馏水配成0.05g/ml混悬液备用。氯化钠注射液(批准号国药准字H61020014，西安京西双鹤药业有限公司);注射用青霉素钠(国药准字 H 23021439，哈药集团制药总厂)80万单位/瓶。

1.3 试剂

中性福尔马林配制方法:40%甲醛100ml，无水磷酸二氢钾 4 .0g，Na2HPO46.5g加蒸馏水 9 00ml。乙二胺四乙酸液(EDTA)配制方法:EDTA5.5g，10%中性福尔马林100ml，用NaOH调整pH为7.0。大鼠血清IGF-1和IL-1β定量测定试剂:ELISA试剂盒购白上海西唐生物科技有限公司，为美国R＆D分装试剂。

1.4 主要仪器

LEICARM2135切片机(Leica公司)，YB-6LF包埋机(孝感市亚光医用电子技术有限公司);DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶标仪(芬兰Thermo公司);Wellwash 4 MK2洗扳机(芬兰Thermo公司);PYX-DHS型数字显示隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂);XW-80A漩涡混合器(上海青浦沪西仪器厂);PYX-YDA-35*40 37℃恒温油电二用恒温培养箱(上海市跃进医疗器械一厂);Nikon eclipse E200生物显微镜(日本Nikon公司)等。

2 方法

2.1 分组

将60只大鼠试验性饲养1周无异常后，随机分为6组(n=10):假手术组、模型组、仙灵骨葆胶囊组、尼尔雌醇组、固本活血壮骨颗粒小剂量组(0.938g/kg，简称小剂量组)、固本活血壮骨颗粒大剂量组(4.69g/kg，简称大剂量组)。

2.2 造模

禁食12h后，以1%戊巴比妥钠40mg/kg剂量作腹腔注射麻醉。麻醉生效后，参考文献[5]。其中，假手术组切除双侧卵巢附近的相当与卵巢大小的小块脂肪，其余组切除双侧卵巢。术后每天每只给予青霉素5万单位，连续3d，防止感染。

2.3 给药方法

喂养1周，开始灌胃。灌胃量:固本活血壮骨颗粒小剂量组为0.938g/kg、大剂量组为4.69g/kg、仙灵骨葆胶囊组为0.469g/kg，1次/d。尼尔雌醇组灌尼尔雌醇混悬液10ml/kg，1次/w。假手术组、模型组灌生理盐水10ml/kg，1次/d。药物剂量每周按体重校正1次。

2.4 取样

游胃90d后处死大鼠。处死前日晚禁食，翌日8∶00采用心脏取血方式取血6ml，然后将其以3000r/min离心15min分离血清，置抗凝管内，存于－20℃冰箱保存待测IL-1β、IGF-1水平。取右侧股骨，钝性分离附着的肌肉组织，标记后置于10%甲醛溶液固定。

2.5 测定指标

血清IGF-1、IL-1β水平测定，由上海西唐生物公司检测，采用ELISA定量测定法，严格按照试剂盒使用说明操作。血清1次解冻，同步测试，在同一实验室内完成测定。

2.6 骨组织HE染色及观察

大鼠右胫骨以10%的中性福尔马林液固定48h，置入pH7.0 EDAT中脱钙30d，至股骨软化有弹性，脱钙成功后取材(右胫骨上端纵横两个切面)，冲水24h，依次酒精上行脱水(70%～80%～90%～95%～100%)、透明、石蜡包埋，4μm厚连续切片，进行HE染色，光镜下观察各组大鼠骨组织态学的变化。

2.7 统计方法

所得数据采用SPSS15.0软件进行统计分析。血清IGF-1和IL-1β结果均用进行描述，统计学分析采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有显著性。

3 结果

3.1 大鼠血清IGF-1水平

表1显示，与A组比较，B组IGF-1水平降低，并且差异有显著性(P＜0.05);各药物组与B组比较，IGF-1水平均高于B组，其中D、F组较B组差异有显著性(P＜0.05)。

表1 IGF-1

表1 IGF-1

注:与A组比较:*P＜0.05;与B组比较:★P＜0.05

组别 n 血清IGF-1(ng/ml)假 手 术 组(A)10 74.374±19.051模 型 组 ( B ) 10 60.696±17.598*尼 尔 雌 醇 组(C) 10 61.544±18.824仙灵骨葆胶囊组(D) 10 69.084±18.365★小 剂 量 组 (E ) 10 64.324±19.867大 剂 量 组 (F) 10 72.518±21.500★

3.2 大鼠血清IL-1β 水平

表2显示，与A组比较，B组IL-1β水平升高，且差异有显著性(P＜0.05);与B组比较，各组IL-1β水平均低于B组，其中D、F组较B组差异有显著性(P＜0.05)。

3.3 各组大鼠骨组织显微结构变化

图1～图6显示，A组骨小梁结构紧密，小梁粗大均匀，骨连续性好;B组骨小梁明显稀疏、细小、萎缩及断裂，骨髓腔径扩大，骨连续性差;C、D、E、F组骨形态均有所改善，骨小梁结构较紧密，数量增加，骨髓腔径缩小，骨连续性较好，其中以D、F组最为显著，已接近A组。

表2 各组大鼠血清IL-1β

表2 各组大鼠血清IL-1β

注:与A组比较:*P＜0.05;与B组比较:★P＜0.05

组别 n 血清IL-1β(pg/ml)假 手 术 组(A)10 3.530±0.879模 型 组 ( B ) 10 5.690±1.870*尼 尔 雌 醇 组 (C) 10 5.658±0.779仙 灵 骨 葆 胶 囊 组(D) 10 3.038±1.083★小 剂 量 组 (E ) 10 4.965±1.255大 剂 量 组 (F ) 10 3.776±0.768★

4 讨论

骨组织的形成需要经过间充质干细胞、骨原细胞、成骨细胞、骨细胞等一系列细胞的增殖、分化，很多细胞因子参与调节成骨细胞的增殖活动，如IGF-1、IL-1β。研究表明，IGF-1可促进细胞增殖、分化，抑制凋亡，是促进骨形成的重要因素[6]。IGF-1与绝经后骨质疏松及其引起的骨折有着密切的关系，可作为一种更加准确且易于检测的骨代谢标志物预测骨质疏松和骨折的发生[7]。IL-1β主要由单核细胞、巨嗜细胞分泌组成，能损伤软骨细胞，抑制软骨细胞的增殖[8]，IL-1β具有损失、抑制软骨细胞增殖的作用[9]。

从实验结果看，模型组与假手术组比较，IGF-1水平降低，IL-1β水平升高，结果有显著性差异性(P＜0.05)，且骨形态有明显的病理性改变，提示模型组大鼠成骨细胞增殖受抑制，破骨细胞增殖活跃，骨丢失明显，说明造模成功。用药组与模型组比较，均提高了IGF-1水平，降低了IL-1β水平，改善了骨形态。其中尼尔雌醇组和小剂量组与模型组比较无显著性差异(P＞0.05)，说明其对骨质疏松症的治疗效果不明显，此结果与前期实验结果一致。仙灵骨葆胶囊组和大剂量组与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)，骨形态改善明显，而小剂量组与模型组比较无显著性差异(P＞0.05)，说明固本活血壮骨颗粒的作用与剂量存在一定量效关系，须达到一定浓度才能使药效达到显著性。

骨质疏松症属于中医学“骨痿”范围，主要与肾虚、脾虚和血瘀有关。其病机特点可概括为本虚(先后天之本脾肾两虚)夹瘀(血行迟缓)的多系统、多脏器的全身性骨骼疾病，治疗大法是固本(补肾填精、益气健脾)活血，以达到壮骨止痛的目的。固本活血壮骨颗粒以鹿角胶、杜仲、仙灵脾补肾助阳、填精壮骨为君药，辅之以黄芪益气健脾为臣，三七等活血止痛为佐药，既培补先后天以充肾精，又达到补中寓通、标本兼治的目的。

研究结果表明，固本活血壮骨颗粒通过提高成骨细胞增殖因子IGF-1水平，降低破骨细胞分化因子IL-1β水平，使骨代谢负平衡状态得以纠正，从而改善骨组织显微结构，对去卵巢大鼠的骨质疏松症具有防治作用;此作用与药物浓度有着正相关性，下一步实验需进一步探讨其量效关系。

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