叶酸偶联华蟾素壳聚糖纳米粒的制备及其特性研究＊

李宏良 田华琴 梁贵文 黄小青 陈学彰 王 斌 杨耀林

广东省佛山市中医医院肿瘤血液科(佛山 528000）

叶酸偶联华蟾素壳聚糖纳米粒的制备及其特性研究＊

李宏良 田华琴△梁贵文 黄小青 陈学彰 王 斌 杨耀林

广东省佛山市中医医院肿瘤血液科(佛山 528000）

目的:制备叶酸偶联壳聚糖载华蟾素纳米粒,并检测其体外性质。方法:首先合成叶酸偶联壳聚糖,再制备负载华蟾素的叶酸偶联壳聚糖纳米粒,并测定叶酸偶联华蟾素壳聚糖纳米粒的载药量、包封率及累积释药量。结果:制备了叶酸偶联华蟾素壳聚糖纳米粒,载药量为9.7%,包封率为61.3%,12h累积释药量为42.6%,72h累积释药量为63.3%。结论:叶酸偶联华蟾素壳聚糖纳米粒制备工艺简单,性能较好。

华蟾素(Cinobufacini）注射剂是传统中药中华大蟾蜍皮的水制剂,其成分为吲哚生物碱,具有抑制肿瘤生长和刺激免疫系统的双重作用,临床广泛用于肿瘤的治疗。但华蟾素存在导致严重的静脉炎等不良反应[1],限制了药物的剂量。为了减轻其不良反应,并提高其抗肿瘤的疗效,本文选择具有减轻化疗药物毒性的壳聚糖(chitosan,CTS）为载体,偶联具有肿瘤靶向的药物——叶酸(FA）,制备负载华蟾素的叶酸偶联壳聚糖纳米粒,同时对其体外性质进行检测。

1材料与仪器1.1 材料 壳聚糖(CTS,济南海得贝海洋生物工程有限公司,脱乙酰度＞90%）,多聚磷酸钠(TPP,国药集团化学试剂有限公司）,叶酸(FA,Sigma公司）,华蟾素(安徽金蟾生化股份有限公司,081005-1）,5-羟色胺对照品(中国药品生物制品检定所,批号:111656-200401）,1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺(EDC,Sigma公司）,无水二甲基亚砜(DMSO,国产分析纯）。

1.2 仪器 78-1磁力加热搅拌器(中国江苏）,冷冻干燥机(德国Lab）,H-600透射电镜(HITACHI）,ZetaSizer3000HS激光粒度分析仪(英国Malvem 公司）,UV-265FW 型紫外分光光度计(日本岛津）、AVantiTM30低温超速离心机(美国）、荧光显微镜(美国Model550）,酶标仪(德国Leica）。

2方法和结果2.1 叶酸偶联壳聚糖的制备及纯化 参照文献[2],称取叶酸(FA）300mg、EDC260mg,溶于15mL无水DMSO中,室温避光磁力搅拌1h至FA全部溶解。加入5mg/mLCTS醋酸水溶液(pH4.7）30mL,室温避光磁力搅拌过夜。用NaOH调节溶液pH至9.0。用PBS液透析3d,再用双蒸水透析3d。冷冻干燥得淡黄色粉末。

2.2叶酸偶联华蟾素壳聚糖纳米粒制备 取6mg叶酸偶联壳聚糖纳米粒溶于5mL1%醋酸溶液中,用NaOH调节pH至5.0,磁力搅拌,并逐滴滴加适量的华蟾素,然后往搅拌的溶液中滴加2mL0.6mg/mLTPP溶液,磁力搅拌30min。将所得溶液双蒸水透析24h,冰浴超声分散30min,过0.45um滤膜,即得载药纳米粒。

2.3 叶酸偶联华蟾素壳聚糖纳米粒的形态学特征及粒径测量 取纳米粒液适量,滴至铺有碳膜的铜网上,静置1min,用2%磷钨酸负染6min,在透射电镜下观察形态和大小。另取纳米粒溶液用激光衍射粒度分析仪测定平均粒径及粒径分布。结果显示透射电镜观察可见球形纳米微粒,粒子形状规则,大小均匀,无粘连。实验测得叶酸偶联华蟾素壳聚糖纳米粒的平均粒径为213.7nm。

2.4 载药量、包封率和累计释放度的测定 2.4.1华蟾素标准曲线的制备:精密称取5-羟色胺对照品10mg,置50mL量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。精密量取对照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL,分别置10mL量瓶中,加水使成5mL,摇匀,加15%对二甲氨基苯甲醛浓盐酸溶液(2→3）至刻度,摇匀,室温放置30min,照分光光度法(《中国药典》2005版第一部附录28）,以水为空白,在555nm波长处分别测定吸收度(A）,以A为纵坐标,浓度(C）为横坐标,绘制标准曲线。其回归方程为:A=0.0074C-0.0896(r=0.9997）,表明 5-羟色胺在 22.3～ 115.2μg/mL 范围内呈良好的线性关系。

2.4.2 叶酸偶联华蟾素壳聚糖纳米粒包封率及栽药量的测定:将制备的载药纳米粒动态透析72h,期间换透析介质水3次,除去黏附未包裹的华蟾素,透析后冷冻干燥。精密称取纯化后叶酸偶联壳聚糖载药纳米球约50mg,置于100mL烧瓶中,加0.1mol/L盐酸溶液50mL,60℃水浴回流3h使纳米球完全溶解,放冷,定容,过滤,取滤液1mL稀释至10mL,于555nm处测定吸光度。按标准曲线计算游离华蟾素的量,并计算包封率和载药量。结果测得包封率为61.3%,载药量为9.7%。

2.4.3 叶酸偶联华蟾素壳聚糖纳米粒体外释药的考察:精密称取冻干后的载药纳米粒5.0mg,溶于1mL磷酸缓冲液(PBS,pH7.4）,取50μL置于微量透析管,悬浮于25mL离心管内,于离心管中加入20mL的磷酸缓冲液(PBS,pH7.4）,将其置水浴振荡器中(温度37℃,振荡频率为100次/min）。分别于第4、8、12、16、20、24、48、72h 取透析袋外 PBS2mL,在555nm处测定吸光度,同时补回等量的释放递质。根据标准曲线方程,计算其浓度和累积释放量,取3次实验的平均值,以累积释药百分率对时间作图,绘制载药纳米粒的释放曲线。华蟾素在各时间点的累积释放百分率(Q）计算公式为:

式中V0为释放递质的总体积,V为每次取样体积,Ct为各时间点测得释放介质中的华蟾素浓度(mg·mL-1）,M 为投入的华蟾素纳米粒的质量(mg）,X为测得华蟾素纳米粒的载药量(%）。叶酸偶联华蟾素壳聚糖纳米粒的释药曲线见突释和缓释两个阶段,突释阶段于12h累积释药量为42.6%,缓释阶段于72h累积释药量为63.3%。见图1。

图1 叶酸偶联华蟾素壳聚糖纳米粒的释药曲线

3讨 论

壳聚糖(CS）是天然生物大分子甲壳素脱乙酰基而得到的碱性多糖,其化学稳定性良好,既有良好的生物相容性及生物可降解性,又有增强机体免疫功能的效应,以壳聚糖包封化疗药物可有效降低其毒性,同时本身也具有一定的抗肿瘤作用[3]。

恶性肿瘤细胞膜表面叶酸受体(FR）的数量及活性显著高于正常细胞。叶酸具有免疫原性低、易于修饰、易穿透肿瘤、到达靶点时间短、血液清除快、稳定性高、成本低、易贮存等优点。叶酸对叶酸受体的亲和力比单克隆抗体对肿瘤细胞表面的受体的亲和力强100倍以上。利用叶酸受体在某些肿瘤部位的过度表达而在正常组织低水平表达的特性可以实现叶酸偶联药物的肿瘤靶向输送。因此,叶酸靶向可成为增加化疗药物对肿瘤细胞敏感性的新途径[4]。

本文选择壳聚糖(chitosan,CS）为华蟾素的载体,利用叶酸活性酯与壳聚糖分子上的氨基反应形成稳定的酰胺键,制备叶酸偶联壳聚糖,利用壳聚糖在偏酸性溶液中带正电荷,在高速磁力搅拌作用下能与阴离子凝集的特性,制备负载华蟾素的叶酸偶联壳聚糖纳米粒,测得载药量为9.7%,包封率为61.3%,12h累积释药量为42.6%,72h累积释药量为63.3%。该制备工艺简单,性能较好。下一步我们将进行体外实验及动物实验评价其肿瘤细胞靶向性及不良反应。

[1] 龚爱平,刘金秀,倪 蓓,等.华蟾素的不良反应(附201例临床观察）[J].徐州医学院学报,1998,18(5）:418-420.

[2] 龚金兰.汪森明.胡喜钢,等.肿瘤靶向性药物载体叶酸壳聚糖微球的制备及特性研究[J].南方医科大学学报,2008,28(12）:2183-2186.

[3] Hejazi R , Amiji M. Chito san-based gastro in testinal delivery system [J ]. J Control Release, 2003, 89 (2） : 151-165.

[4] Low PS, Antony A C. Folaterecep tor-targeted drugs for cancer and inflamm atory diseases[J ]. Adv Drug Rev, 2004,56: 1055-1058.

华蟾素/生产和制备 工艺,药学 纳米

R285

A

1000-7369(2011）05-0610-03

＊佛山市科技局医学类科技攻关项目(佛科[2007]29号）

△通迅作者。

(收稿2010-09-03;修回2010-10-09）