AN221 HPLC-UV、Acclaim混合基质柱WCX-1快速检测液体奶和奶粉中的三聚氰胺

AN221 HPLC-UV、Acclaim混合基质柱WCX-1快速检测液体奶和奶粉中的三聚氰胺

戴安(DIONEX)仪器分析园地

三聚氰胺是一种用于塑料和化学肥料生产的化学原料.最近出现了一些婴儿食品(奶粉)被三聚氰胺污染的现象.不法分子通过掺加三聚氰胺来提高奶粉中蛋白质测定量，三聚氰胺也被掺到动物饲料中以提高蛋白质测定量.

三聚氰胺的定量检测方法有酶免疫测定法(EIA)、GC-MS、LC-MS、HPLC-UV等.中国政府颁布的检测原奶和奶制品中三聚氰胺检测方法包括了HPLC-UV、LC-MS和GC-MS，但是GC/LC-MS的正常运行需要很高的成本，并且GC-MS样品衍生化需要较高的劳动强度，这样就限制了该标准在奶制品企业中的推广应用，因此HPLC-UV方法仍是目前在奶制品企业中普及的检测方法.针对大批量需要检测的原奶，推荐另一种HPLC-UV方法快速检测原奶，但是该方法在奶制品的检测中具有局限性.

本文介绍一种简单的HPLC方法，同时快速检测液体奶和奶粉中三聚氰胺.该方法使用Acclaim混合基质WCX-1色谱柱、UltiMate® 3000 HPLC-UV高效液相色谱、醋酸盐缓冲液和乙腈为流动相进行检测.单个样品10 min内完成分析.Acclaim混合基质WCX-1色谱柱使用硅胶基质，其分离原理含有疏水和弱离子交换特点，对离子化和中性的化合物表现出了很好的分离特性.使用UltiMate® 3000 HPLC-UV高效液相色谱和Acclaim混合基质WCX-1色谱柱能同时快速分析液体奶和奶粉中的三聚氰胺.

1 实验方法

1.1 仪器与试剂

仪器:Dionex UltiMate 3000 HPLC系统包括有HPG 3400A泵，WPS 3000TSL自动进样器，TCC-3000柱温箱，VWD-3400RSUV-Vis检测器.Dionex SummitUVD-340U PDA，Chromeleon® 6.80 SP5工作站.Kudos® SK3200LH 超声波发生器(KudosUltrasonic Instrumental Co.，Shanghai，China)，梅特勒 Toledo AL-204 电子天平(梅特勒(上海)公司，上海)，Anke®TGL-16B离心机(Anting科学仪器公司，上海)，IKA® MS1微型振荡器(广州)

试剂与标准品:水，Milli-Q® Gradient A 10;甲醇(CH3OH)，HPLC级，Fisher;乙腈(CH3CN)，HPLC级，Fisher;醋酸铵(NH4Ac)，分析纯，SCRC，China;醋酸(HAc)，分析纯，SCRC，China;辛烷磺酸钠 (98%)，色谱纯，USA;三聚氰胺(99.0%)，HPLC 级，Fluka.

色谱条件:保护柱:Acclaim混合基质WCX 1，5μm，4.3 mm ×10 mm，P/N 068354，预柱，P/N 59526;分析柱:Acclaim混合基质WCX-1，5μm，4.6 mm ×250 mm，P/N 068352;柱温:30℃;流动相:醋酸盐缓冲系统 (700 mL，10 mmol·L－1HAc 和 300 mL，10 mmol·L－1NH4Ac 混合，pH 4.3)-CH3CN(8∶2，V/V);流速:1.0 mL·min－1;进样体积:20μL;紫外检测器:吸收波长240 nm.

1.2 标准品溶液的制备

标准品储备液:精密称定100 mg的三聚氰胺，用50%甲醇水溶液定容在100 mL容量瓶中，得到三聚氰胺浓度为1000 μg·mL－1.

标准溶液:制备7份标样用来校准，每个标样加入一定量的标准品储备液，醋酸水溶液流动相稀释，三聚氰胺的浓度分别是 0.05、0.1、0.2、1.0、5.0、20 和 40 μg·m L－1.

奶粉样品:加入1 g左右精确称重的干燥奶粉样品至15 mL离心管，添加10 mL水，涡流振荡1 min后，超声波超声30 min.取出，滴加1 mL乙酸溶液(3%，V/V)，4℃下放置至少30 min后，离心15 min(10000 r·min－1)，移取上清液至10 mL容量瓶中，水定容至刻度，进样前，0.2μm微孔滤膜过滤.

液体奶样品:精确量取10 mL液体奶样品至15 mL体积离心管后，直接加入1 mL的的乙酸(3%，V/V)洗脱液，4℃下静置30 min.余下操作步骤同奶粉样品处理.

奶粉和液体奶加标回收:加入40μL三聚氰胺标准品储备液至15 mL离心管中，分别加入已精确称定1 g左右的干燥奶粉和精确量取10 mL左右的液体奶，余下步骤同奶粉和液体奶的操作.

2 结果与讨论

2.1 优化牛奶和奶粉样品的制备过程

一般处理牛奶和奶粉样品分两个步骤，样品提取和SPE小柱净化，50℃ N2吹干.离子交换分析法(IEX)的处理方法比此更简便，但是只适用于液体奶检测.因此开发一种高效而更简便并同时处理牛奶和奶粉的方法十分必要.我们开发的方法不需要过SPE小柱和样品干燥，只需加入乙酸洗脱液，离心，过滤，该方法同时适用于液体奶和奶粉检测，也适用反相离子对色谱方法(RP-PIC)分析.图1表明，三聚氰胺检测波长240 nm，该样品制备方法无论使用Acclaim混合基质WCX-1色谱柱或者RP-PIC方法的Acclaim 120 C18色谱柱，都能得到很好的三聚氰胺图谱，目标峰无杂质峰干扰.

图1 牛奶样品和牛奶样品加标图谱(A.Acclaim混合基质WCX-1色谱图;B.Acclaim 120 C18色谱图)

2.2 优化色谱条件

三聚氰胺是亲水性成分，在经典RP反相色谱柱(例如C18或C8)中保留较弱，大多数反相柱使用离子对试剂，流动相中添加离子对试剂，例如辛烷磺酸盐，三聚氰胺就能很好地保留.然而，离子对试剂可能会污染固定相，会改变反相柱的保留性能，如果这根色谱柱换成其它分离方法时，可能就得不到原色谱峰.RP-PIC方法通常不适合同MS检测器连接，因此尝试在Acclaim混合基质WCX-1色谱柱上分离离子化的三聚氰胺，醋酸缓冲盐洗脱.

Acclaim混合基质WCX-1色谱柱特性是混合硅胶基质填料，同时具有疏水性和弱离子交换特性，流动相pH值能影响到固定相的电荷数和疏水性，当流动相pH值低于固定相羧酸根的p Ka值时，离子交换作用失活，因此疏水作用成为保留机制的主要作用.当流动相pH高于固定相p Ka值时，离子交换作用激活，因此两种分离机制都对被分析物的保留有影响，保留时间取决于分析物特性.大量实验结果发现，流动相缓冲盐pH值低于3.5或大于5.0时，三聚氰胺都没有被很好地保留.离子交换作用是能改变带电荷化合物在色谱柱中保留的关键因素，在碱性环境中流动相离子浓度增加后，三聚氰胺保留时间降低;疏水性保留特性明显受有机相比例影响，增加有机相比例后，其它的条件(例如离子作用力、pH、温度等)保持不变，所有种类的分子(酸、碱和中性化合物)保留时间都会提前.

针对液体奶和奶粉样品，流动相为10 mmol·L－1醋酸铵，pH=4.3，20%MeCN.对于更复杂的样品，应当使用更强缓冲能力的缓冲盐溶液，同时三聚氰胺的保留时间提前，而减少流动相中乙腈的比例不大可能恢复原来的保留时间位置.

2.3 色谱性能

图2为三聚氰胺标准品溶液5次连续进样色谱图，每次进样20μg·mL－1，保留时间和峰面积重复性良好.三聚氰胺标准曲线由7个不同浓度的标准品溶液制得，每个标准液重复进样5次.标准曲线和样品定量使用外标法，如图3，线性范围0.05—40 μg·mL－1，线性方程为:A=0.9120C，相关系数0.9999，曲线通过原点.

图2 5次20μg·mL－1三聚氰胺标准溶液连续进样重叠图

图3 三聚氰胺标准曲线

重复性方法学考察通过10次连续进样1μg·mL－1标准品溶液.保留时间RSD为0.037，峰面积的RSD为0.472.三聚氰胺检测限MDL计算公式:式中，S=重复分析标准差，n=重复次数，t(n－1，1－α=0.99)=置信度99%、自由度 n－1的Student's t值.1 μg·mL－1标准品溶液重复进样10 次计算的检测限 MDL 为0.015 μg·mL－1.

2.4 样品分析

取5份样品，包括3份奶粉(1#—3#)和2份液体奶(4#和5#)，用新前处理方法和WCX色谱法进行分析，结果发现，1#样品中没有检测到三聚氰胺，而其它5份样品都检测到了三聚氰胺.图4显示了所有色谱图.另在1#和4#样品处理前加标样三聚氰胺，结果两个样品出现了明显的三聚氰胺色谱峰.

图4 色谱图 (A.奶粉1#— 3#;B.液体奶4#和5#)

2.5 样品制备和分析方法的对比

取3份奶粉样品，1#—3#，和另外3份奶粉样品6#—8#，分别使用我们的新方法和活化SPE小柱的奶粉检测方法(GB/T 22388 2008)，制备后的样品分别用Acclaim 120 C18色谱柱、GB/T 22388 2008色谱条件分析方法A和Acclaim混合基质WCX-1色谱柱、以上述色谱条件分析分析方法B，结果见表1.全部样品结果包括两种样品制备过程和两种色谱方法的分析，数据对比表明，全部6份样品使用这两种样品制备方法或色谱分离方法后，结果一致性良好.

表1 牛奶样品检测结果对比(mg·kg－1)

对于复杂基质的奶制品可能有三聚氰胺假阳性，与三聚氰胺标准品溶液对比紫外光谱图是有效的办法.分析样品8#时，分别使用GB/T 22388 2008中的样品制备方法和混合基质WCX-1色谱柱方法，发现一个和三聚氰胺保留时间接近的小峰，将此峰标记为三聚氰胺时浓度为3.3 mg·kg－1.使用其它样品处理方法和色谱方法没有在该样品中检测到三聚氰胺.在VWD紫外检测器后连接一个PDA阵列检测器，对比紫外光谱图，如图5中所示，结果显示该色谱峰不是三聚氰胺，使用PDA阵列检测器分析有助于减少三聚氰胺假阳性误判.

图5 UV光谱图(A.三聚氰胺标准溶液;B.假定的三聚氰胺色谱峰)

3 结论

本文开发了一个快速处理检测液体奶和奶粉样品中三聚氰胺的高效简便方法.方法使用Acclaim混合基质WCX-1色谱柱和醋酸铵缓冲盐与乙腈为流动相的分析方法进行检测，三聚氰胺得到很好地保留，并可同时兼容MS检测器.