2种蓼科植物体外抑菌试验研究

林燕文

(惠州学院生命科学系，广东惠州516007)

水蓼(Polygonum hydropiper L.)、火炭母(Polygonum chinense L.)均为蓼科(Polygonaceae)蓼属(Polygonum L.)植物，是我国传统的中药材，都有清热解毒、止血止痛的药用作用［1-2］。水蓼又名辣蓼，为一年生草本植物，全草及根含挥发油、萜类、黄酮及黄酮苷类等成分［3-4］。火炭母又名清饭藤、火炭藤、赤地利、川七等，为多年生草本植物，其主要化学成分有黄酮类、鞣质、甾醇类等［5-6］。这2种蓼科植物在我国南方地区广泛分布，国内外对它们的研究主要有化学成分分析、医药、兽药、植物源杀虫剂开发等［3-7］，近年来，关于这2种植物体外抑菌作用陆续有报道，但主要是其中某些化学成分，如黄酮、挥发油、鞣质、根及叶提取物或其与别的中草药复方提取物等的抑菌研究［8-9］。本研究采用这2种植物全株的水煎煮液开展抑菌试验，通过测定抑菌圈、最小抑菌浓度及温度对抑菌效果的影响等来探讨其抑菌效果，旨为拓宽水蓼、火炭母乃至蓼科植物的应用领域提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料水蓼、火炭母，均采自广东省潮州市慧如公园，洗净后80℃烘干备用。

1.1.2 供试菌种枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、青霉(Penicillium citrinum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，由韩山师范学院微生物室提供。

1.1.3 培养基牛肉膏蛋白胨固体培养基和液体培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基。

1.1.4 试剂氯化钠、盐酸、蔗糖等均为分析纯，购自广州化学试剂厂;牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉均为生物化学试剂，购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.5 仪器LDZX-50KB不锈钢自动型压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂;SW-CJ-IC型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司;SPX-270型培养箱，宁波市科技园区新江南仪器有限公司;DGX-9243B-1鼓风干燥箱，上海福玛实验设备有限公司;PHS-3D PH计，上海雷磁等。

1.2 方法

1.2.1 水蓼、火炭母水煎煮液的制备称取100 g水蓼，剪碎并研磨，加入500 mL蒸馏水，浸泡30 min，小火煮沸30 min，抽滤得滤液，药渣再加500 mL蒸馏水，小火煮沸30 min，再次抽滤得滤液，合并2次滤液，然后小火加热蒸发浓缩至100 mL，制成含生药量为1 g/mL水蓼水煎煮液。将水蓼改成火炭母，制法同上，制得含生药量为1 g/mL火炭母水煎煮液，将2种水煎煮液置4℃保存待用。

1.2.2 菌悬液的制备［10］将枯草芽胞杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌3种供试细菌菌种分别接于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，37℃恒温培养24 h后，取1环接于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置37℃恒温培养24 h。进行平板菌落计数，根据计算结果用无菌生理盐水将菌液调至约为106cfu/mL，4℃保存待用。将黑曲霉、青霉、酿酒酵母3种供试真菌菌种分别接于马铃薯蔗糖斜面培养基上活化，2种霉菌28℃培养72 h形成孢子后，用无菌生理盐水把斜面上的孢子冲洗到灭菌试管中，酵母菌28℃培养48 h后用无菌生理盐水将菌苔刮洗到灭菌的试管中，摇匀，然后用血球计数板进行计数。根据计数结果，用无菌生理盐水将2种霉菌孢子液及酵母菌液调至约为106cfu/mL，4℃保存待用。

1.2.3 抑菌实验①抑菌圈大小测定［11-12］:用无菌刻度吸管吸取1 mL供试细菌液置于无菌培养皿中，再倒入溶化并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基约15 mL，轻轻转动培养皿，使菌液与培养基混合均匀，冷凝制成平板。将含生药量为1 g/mL的水蓼、火炭母水煎煮液分别用无菌水稀释成浓度为0.8、0.6、0.4、0.2、0 g/mL(对照)的药液。用无菌镊子将直径为6 mm的灭菌干燥滤纸片分别放入装有各浓度药液的培养皿中浸泡30 min，然后取出滤纸片，在培养皿内壁上滤去多余的药液，将滤纸片贴入上述平板的表面，每皿贴3片，每菌每种浓度重复做3次，贴好滤纸片的平板在室温下放置20 min后倒置于37℃恒温培养24 h，取出测定抑菌圈直径大小，比较抑菌效果。用无菌刻度吸管吸取1 mL供试真菌(孢子)液置于无菌培养皿中，再倒入溶化并冷却至50℃左右的马铃薯蔗糖琼脂培养基约15 mL，轻轻转动培养皿，使菌液与培养基混合均匀，冷凝制成平板。按上面方法稀释药液、浸泡、粘贴滤纸片，将贴好滤纸片的平板在室温下放置20 min后倒置于28℃恒温培养48～72 h，取出测定抑菌圈直径大小，比较抑菌效果;②最小抑菌浓度(MIC)测定:采用试管2倍稀释法测定MIC［12］。取10支灭菌试管，各管分别加入牛肉膏蛋白胨液体培养基1 mL，在第1管中加入1 mL灭菌的生药量为1 g/mL植物水煎煮液，混匀后吸取1 mL加入到第2管中，依次类推，直至第8管，第8管吸取1 mL弃去，使其成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16等浓度梯度。向1～8管中分别加入0.05 mL菌液，第9管不加植物水煎煮液，加菌液0.05 mL作为对照，以观察细菌的生长情况。第10管加植物水煎煮液1 mL，混匀后，不加菌液，以观察植物水煎煮液是否被污染。重复实验3次，将各管置于37℃恒温培养24 h，观察结果。若药液透明，可直接判定结果，若色泽较深，则用接种环挑取1环培养液于牛肉膏蛋白胨固体培养基上划线培养18～24 h，观察结果，以无菌生长的最低稀释度为MIC;③温度对抑菌效果影响测定:将生药量为0.5 g/mL的2种植物水煎煮液经121℃高压蒸汽灭菌处理后，采用①中所用的滤纸片法测定抑菌圈直径，以确定高压蒸汽灭菌对2种植物水煎煮液抑菌效果的影响。

1.2.4 数据分析所得数据采用SPSS 17.0软件分别进行多重比较分析和t检验分析。

2 结果与分析

2.1 抑菌圈大小的测定结果

采用滤纸片法测定水蓼、火炭母水煎煮液的抑菌圈直径，结果发现，这2种植物对黑曲霉、青霉、酿酒酵母均无抑制作用，它们对3种供试细菌的抑制作用结果见表1。

表1 水蓼、火炭母水煎煮液对供试细菌的抑菌圈直径(单位:mm)Table 1 Diameter of inhibition zone of water extract from Polygonum hydropiper L.and Polygonum chinense L.on experiment bacteria(unit:mm)

由表1可知，水蓼、火炭母的水煎煮液在一定浓度范围内(≤1.0 g/mL)，对3种供试细菌都有一定的抑制作用，特别是对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑制作用，两者随着药液浓度的增加而有显著增强。当水蓼液浓度大于0.6 g/mL，火炭母液浓度大于0.2 g/mL时，两者对3种供试细菌的抑菌效果均依次为金黄色葡萄球菌＞大肠埃希菌＞枯草芽胞杆菌。当药液浓度相同时，对于同一种细菌的抑制作用，火炭母液要强于水蓼液。另外，当水煎煮液浓度较低(≤0.4 g/mL)时，水蓼液对枯草芽胞杆菌的抑制作用不明显。由表1还可见，当水煎煮液浓度在1.0 g/mL时，火炭母对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑菌圈直径分别达14.6 mm和11.2 mm，具有很好的抑菌效果，水蓼对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达11.0 mm，也具有很好的抑菌效果;当水煎煮液浓度在0.8 g/mL时，火炭母对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑菌圈直径分别为13.4 mm和10.3 mm，仍具有很好的抑菌效果，水蓼对金黄色葡萄球菌也仍有较好的抑菌效果，抑菌圈直径达10.0 mm以上。

2.2 最小抑菌浓度的测定结果

在2.1中水蓼、火炭母水煎煮液对黑曲霉、青霉、酿酒酵母均无抑制作用，所以，只采用试管2倍稀释法测定水蓼、火炭母水煎煮液对3种细菌的MIC，结果见表2。从表2可知，水蓼、火炭母水煎煮液对3种供试细菌的MIC大小均依次为金黄色葡萄球菌＜大肠埃希菌＜枯草芽胞杆菌，即2种植物水煎煮液对金黄色葡萄球菌抑制作用最强，对大肠埃希菌抑制作用次之，对枯草芽胞杆菌抑制作用最弱。另外，对于同一种供试细菌而言，火炭母的MIC较水蓼的MIC小，即火炭母的抑菌效果强于水蓼，如表2中火炭母水煎煮液对金黄色葡萄球菌的MIC是1/64 g/mL、远比水蓼水煎煮液对金黄色葡萄球菌的MIC 1/16 g/mL小。

表2 水蓼、火炭母水煎煮液对供试细菌的MICTable 2 MIC of water extract from Polygonum hydropiper L.and Polygonum chinense L.on experiment bacteria

2.3 温度对抑菌效果影响的测定结果

水蓼、火炭母水煎煮液灭菌后对黑曲霉、青霉、酿酒酵母仍无抑制作用，这2种植物水煎煮液灭菌前后对供试细菌的抑菌圈直径见表3。

表3 水蓼、火炭母水煎煮液灭菌前后对供试细菌的抑菌圈直径(单位:mm)Table 3 Diameter of inhibition zone of water extract from Polygonum hydropiper L.and Polygonum chinense L.on experiment bacteria before and after sterilization(unit:mm)

表3结果表明，水蓼、火炭母水煎煮液中的抑菌物质热稳定性较好，经121℃高压蒸汽灭菌处理后，水蓼水煎煮液对金黄色葡萄球菌的抑制效果较灭菌前有极显著增强，对大肠埃希菌和枯草芽胞杆菌的抑制效果较灭菌前稍有增强;火炭母水煎煮液对金黄色葡萄球菌的抑制效果较灭菌前稍有增强，对大肠埃希菌和枯草芽胞杆菌的抑制作用，灭菌前后变化不大。

3 讨论

本实验将水蓼、火炭母全株作为材料制备水煎煮液，探讨它们对枯草芽胞杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、青霉、酿酒酵母的抑制作用，发现这2种植物的水煎煮液在一定浓度范围内对上述3种细菌均有不同程度的抑制作用，尤其对金黄色葡萄球菌有很好的抑菌效果，而它们对上述3种真菌没有抑制作用。2种植物的水煎煮液即使经高压灭菌处理，对上述3种细菌的抑制作用仍未减弱，有的甚至有所增强，这可能是高压灭菌时，药液中具抑菌作用的鞣质等化学成分充分溶出或是高温加热过程中，不同成分间发生系列化学反应，生成了新的抗菌物质，而不同细菌对这类抗菌物质的耐性存在差异所致。

水蓼、火炭母在我国分布面积广泛，资源丰富，若能以其为原料进行植物源抗菌剂的开发，可为食品、医药等行业做出一份贡献，并将具有广阔的前景和深远的意义。

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