沼泽生红冬孢酵母生长及产类胡萝卜素培养条件的研究

杨世平，吴灶和，简纪常

(1.广东海洋大学广东省海洋开发研究中心，广东湛江524025;2.广东海洋大学水产学院，广东湛江524025;3.广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东湛江524025)

类胡萝卜素是一类多烯类化合物，呈黄色或红色，因为可以转化为维生素A，并具有着色、抗氧化和抗癌等作用，被广泛用于制药、化学、食品和饲料工业等方面。动物不能合成类胡萝卜素，只能从食物中获取［1］。某些植物、藻类、细菌和真菌(包括酵母)可以产生类胡萝卜素。能产生类胡萝卜素的酵母主要有红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)和掷孢酵母属(Sporobolomyces)的一些种类，其主要色素包括β-胡萝卜素(β-carotene)、圆酵母素(torulene)、红酵母红素(torularhodin)和虾青素(astaxanthin)［2］。红酵母还含有丰富的蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、糖类和维生素等各种生理活性物质，是水产经济动物优良的天然饵料［3］，并已经被用于促进生长［4］、改善肠道微生物结构［5］、改变水产养殖动物的体色［6］和降低水产动物的氧化压力［7］等方面。近年来已有厂家开始生产红酵母，并用于饲料添加剂中［4］。红酵母对营养要求不高，可以利用一些农业原材料作为培养基，包括水解绿豆废粉、糖蜜和玉米浆等进行培养，这也利于红酵母的大规模培养和应用推广。实验菌株为湛江对虾养殖区海水中分离、筛选的沼泽生红冬孢酵母(Rhodosporidium paludigenum)，实验证明该菌株在对虾肠道具有一定黏附能力，能显著提高凡纳滨对虾生长率、存活率以及对虾肝胰腺和血清中部分抗氧化酶活力，降低对虾的抗氧化压力［8］。本文研究了其生长和产类胡萝卜素的培养条件，为沼泽生红冬孢酵母的大规模培养和进一步在水产养殖中开发利用提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株沼泽生红冬孢酵母(R.paludigenum)为本实验室从湛江对虾养殖区海水中分离、筛选的菌株。在麦芽汁平板上培养1～2 d，生长出红色小菌落，菌落直径约为2～5 mm。菌落表面光滑，有光泽，质地黏稠，边沿较为整齐。细胞形态为球形或椭圆形，单个或多个细胞相连。

1.1.2 培养基活化培养基(YPD，%):酵母膏1.0，蛋白胨2.0，葡萄糖2.0，琼脂2.0，pH 6.0;发酵培养基(%):葡萄糖2.5，酵母膏1.0，MgSO4·7H2O 0.01，K2HPO40.2，KH2PO40.2，pH 6.0［9］。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养将菌种接种在YPD固体培养基上活化，28℃培养48 h，接种于装有发酵培养基的三角瓶中，装液量为50 mL/250 mL，28℃150 r/min，培养48 h作为种子液;再以10%接种量接入相应的培养基中，相同培养条件培养72 h，发酵结束后经离心收集菌体并测定生物量和类胡萝卜素含量，计算单位体积发酵液的生物量和类胡萝卜素产量，确定发酵条件。

1.2.2 单因素实验分别进行不同碳源、氮源、盐度、pH值、温度、装液量、接种量和摇床转速对沼泽生红冬孢酵母生长和产类胡萝卜素的影响实验。以发酵培养基为基础，改变相应的培养基组成和培养条件进行实验，各设3个重复。

1.2.3 正交实验培养基优化采用3因素3水平L9(33)正交实验，共设有9个处理，每个处理设3个重复。根据单因素实验的结果，选择葡萄糖、牛肉膏和酵母膏作正交实验，最后筛选出优化组合。

1.2.4 细胞生物量测定将培养液以4 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀用蒸馏水清洗2次，所得菌体置于65℃烘箱中干燥至恒重，称重。

1.2.5 类胡萝卜素的测定二甲基亚砜法［10］。

1.2.6 数据处理和统计分析单因素实验结果采用SPSS11.5软件进行数据处理和统计分析，Duncan检验法进行均值间多重比较(以P＜0.05作为差异显著水平)，并在图中进行标注(同一柱形图中相同图案条形柱上字母不同表示差异显著)。正交实验结果采用正交设计助手Ⅱ(V3.1)软件进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对沼泽生红冬孢酵母生长和产类胡萝卜素的影响

图1 不同碳源对沼泽生红冬孢酵母生长和产类胡萝卜素的影响Fig.1 Effects of carbon sources on growth and production of carotenoid by R.paludigenum

分别以2.5%葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉和红糖为碳源，进行发酵培养。由图1可见，碳源对沼泽生红冬孢酵母的生物量及类胡萝卜素产量都有显著的影响(P＜0.05)。以蔗糖为碳源时，生物量最高，但其类胡萝卜素产量却显著低于葡萄糖和红糖作为碳源时的产量。以葡萄糖为碳源时，类胡萝卜素产量最高，与Bhosale等［9］对粘红酵母(Rhodotorula glutinis)培养条件的研究结果相似，因此，本实验选择葡萄糖作为沼泽生红冬孢酵母发酵时的碳源。以红糖为碳源时，仍能取得较大的生物量及类胡萝卜素产量，加上红糖价格较低，大规模生产和应用可以利用红糖作为碳源。

2.2 不同氮源对沼泽生红冬孢酵母生长和产类胡萝卜素的影响

在总含氮量相同情况下，分别以蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硫酸铵和硝酸钠为氮源进行不同氮源对生物量和类胡萝卜素的影响实验。为了保证生物素等微量成分的供应，培养基中均额外增加了0.5%的酵母膏。由图2可见，氮源对沼泽生红冬孢酵母的生物量及类胡萝卜素产量都有显著的影响(P＜0.05)，最利于类胡萝卜素合成的氮源是牛肉膏，其次是蛋白胨，与孙乃霞等［11］培养法夫酵母(Phaffia rhodozyma)的研究结果相同。同时发现有机氮要比无机氮更利于红酵母类胡萝卜素的积累，与有关报道结果相似［12］。

图2 不同氮源对沼泽生红冬孢酵母生长和产类胡萝卜素的影响Fig.2 Effects of nitrogen sources on growth and production of carotenoid by R.paludigenum

2.3 起始pH值对沼泽生红冬孢酵母生长和产类胡萝卜素的影响

pH值能够影响微生物对营养物质的吸收、利用和代谢产物的分泌，也影响微生物所产生的酶种类和活力，使代谢途径和细胞膜的通透性发生变化［13］。由图3可见，起始pH对沼泽生红冬孢酵母的生物量和类胡萝卜素产量有显著影响(P＜0.05)，当起始pH值为6.3时生物量和类胡萝卜素产量最高，因此，沼泽生红冬孢酵母发酵的最适初始pH值为6.3左右。

图3 起始pH值对沼泽生红冬孢酵母生长和产类胡萝卜素的影响Fig.3 Effects of initial pH values on growth and production of carotenoid by R.paludigenum

2.4 装液量对沼泽生红冬孢酵母生长和产类胡萝卜素的影响

图4 装液量对沼泽生红冬孢酵母生长和产类胡萝卜素的影响Fig.4 Effects of volumes on growth and production of carotenoid by R.paludigenum

装液量可以影响培养基中溶氧的浓度，从而影响红酵母的生长和类胡萝卜素的生产。在250 mL三角瓶中分别装入不同体积的发酵培养基，进行发酵实验。结果见图4，装液量对沼泽生红冬孢酵母的生物量和类胡萝卜素产量都有显著的影响(P＜0.05)，且其生物量及类胡萝卜素产量都随装液量的增加而降低。对类胡萝卜素来说，装液量为50 mL/250 mL时，每瓶每培养1次的类胡萝卜素产量最高，为0.13 mg。

2.5 摇床转速对沼泽生红冬孢酵母生长和产类胡萝卜素的影响

摇床转速可以影响培养基中溶氧的浓度，从而影响沼泽生红冬孢酵母的生长和类胡萝卜素的生产。但培养基中溶解氧浓度有上限值，达到这个值后摇床转速继续增加，溶解氧也不会增加，且摇床转速过快，产生的剪切力也将增大，影响菌体的生长，甚至使细胞破碎死亡［14］。实验结果见图5，转速为170 r/min时，可以得到最大的生物量和类胡萝卜素产量。

图5 摇床转速对沼泽生红冬孢酵母生长和产类胡萝卜素的影响Fig.5 Effects of rotating speed on growth and production of carotenoid by R.paludigenum

2.6 NaCl对沼泽生红冬孢酵母生长和产类胡萝卜素的影响

本实验的沼泽生红冬孢酵母是从海水中分离得到的，也将应用到海水养殖中去。根据海洋环境的特点，研究了不同浓度的NaCl对其生物量及类胡萝卜素产量的影响。由图6可见，NaCl对其生物量及类胡萝卜素产量有显著影响(P＜0.05)。当NaCl浓度在10 g/L时，沼泽生红冬孢酵母的生物量及类胡萝卜素产量最高，这与张志军等［15］研究海洋红酵母(Rhodotorula sp.)时的结果相似。当NaCl浓度在10～40 g/L的范围内时，随NaCl浓度的增加其生物量和类胡萝卜素产量不断下降，说明高浓度的NaCl抑制了细胞生长和类胡萝卜素的积累。但当NaCl浓度为40 g/L时，其生物量和类胡萝卜素产量仍分别为NaCl浓度为10 g/L时的81.1%和92.4%，说明其对盐度有一定的耐受能力。

图6 NaCl对沼泽生红冬孢酵母生长和产类胡萝卜素的影响Fig.6 Effects of NaCl on growth and production of carotenoid by R.paludigenum

2.7 培养温度对沼泽生红冬孢酵母生长和产类胡萝卜素的影响

图7 培养温度对沼泽生红冬孢酵母生长和产类胡萝卜素的影响Fig.7 Effects of temperature on growth and production of carotenoid by R.paludigenum

培养温度是影响酵母生长和类胡萝卜素积累的重要因素之一。由图7可看出，温度对沼泽生红冬孢酵母的生物量和类胡萝卜素产量有显著的影响(P＜0.05)。当培养温度为28℃时，其类胡萝卜素产量最高。当培养温度为22℃时，其生物量和类胡萝卜素产量最低，分别是培养温度为28℃时的96%和87%，说明沼泽生红冬孢酵母对温度的适应范围也较广。

2.8 不同接种量对沼泽生红冬孢酵母生长和产类胡萝卜素的影响

不同接种量对沼泽生红冬孢酵母生物量和类胡萝卜素产量仍有显著的影响(P＜0.05)，以10%的接种量最佳。

图8 接种量对沼泽生红冬孢酵母生长和产类胡萝卜素的影响Fig.8 Effects of inoculum size on growth and production of carotenoid by R.paludigenum

2.9 正交实验结果

单因素实验结果来看，沼泽生红冬孢酵母产类胡萝卜素的最优碳源是葡萄糖，氮源是牛肉膏。为了保证生物素等微量成分的供应，培养基中特别添加了酵母膏，并以这3种培养基成分作为正交实验的3个因素，每个因素选3个水平，如表1所示，进行正交实验。由表2可知，影响沼泽生红冬孢酵母生物量的因素主次顺序为ACB，即葡萄糖含量对其生物量的影响最大，酵母膏次之;而影响其类胡萝卜素产量的因素主次顺序为BAC。为获得较高的生物量和类胡萝卜素产量，选择A2B1C2，即葡萄糖40 g/L，牛肉膏为10 g/L，酵母膏10 g/L为沼泽生红冬孢酵母培养的最优组合。

表1 正交实验因素水平Table 1 The factors and levels of orthogonal test

表2 正交实验结果和极差分析表Table 2 Results and intuitive analysis of orthogonal experimental design

3 结论

对沼泽生红冬孢酵母生长和产类胡萝卜素培养条件的单因素实验表明，各因素的最优条件如下:葡萄糖为碳源，牛肉膏为氮源，NaCl为10 g/L，培养温度为28℃，初始pH为6.3，摇床转速为170 r/min，装液量为50 mL/250 mL，接种量为10%。实验结果表明，沼泽生红冬孢酵母对pH、温度和盐度均有较广的耐受范围，有利于大规模培养和应用。正交实验表明，影响沼泽生红冬孢酵母生物量的因素主次顺序为:葡萄糖＞酵母膏＞牛肉膏，而影响其类胡萝卜素产量的因素主次顺序为牛肉膏＞葡萄糖＞酵母膏。为获得较高的生物量和类胡萝卜素产量，选择A2B1C2，即葡萄糖40 g/L，牛肉膏为10 g/L，酵母膏10 g/L为沼泽生红冬孢酵母培养的最优组合。

［1］ Frengova GI，Beshkova DM.Carotenoids from Rhodotorula and Phaffia:yeasts of biotechnological importance［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2009，36:163-180.

［2］ Maldonade IR，Rodriguez-Amaya DB，Scamparini ARP.Carotenoids of yeasts isolated from the Brazilian ecosystem［J］.Food Chem，2008，107:145-150.

［3］ 夏霄鹤.海洋红酵母—健康的微生态活菌制剂［J］.中国校外教育，2009，9:49.

［4］ 陈昌福，姚鹃，肖雪生，等.海洋1号红酵母饲养日本对虾幼虾的效果［J］.淡水渔业，2004，34(6):55-57.

［5］ Andlid T，Juárez RV，Gustafsson L.Yeast colonizing the intestine of rainbow trout(Salmo gairdneri)and turbot(Scophtalmus maximus)［J］.Microb Ecol，1995，30:321-334.

［6］ Bjerkeng B，Peisker M，Schwartzenberg KV，et al.Digestibility and muscle retention of astaxanthin in Atlantic salmon，Salmo salar，fed diets with the red yeast Phaffia rhodozyma in comparison with synthetic formulated astaxanthin［J］.Aquaculture，2007，269:476-489.

［7］ Nakano T，Kanmuri T，Sato M，et al.Effect of astaxanthin rich red yeast(Phaffia rhodozyma)on oxidative stress in rainbow trout［J］.Biochim Biophys Acta，1999，1426:119-125.

［8］ Yang SP，Wu ZH，Jian JC，et al.Effect of marine red yeast Rhodosporidium paludigenum on growth and antioxidant competence of Litopenaeus vannamei［J］.Aquaculture，2010，309:62-65.

［9］ Bhosale P，Gadre RV.Production of β-carotene by a mutant of Rhodotorula glutinis［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2001，55:423-427.

［10］ Cong L，Chi ZM，Li J，et al.Enhanced carotenoid production by a mutant of the marine yeast Rhodotorula sp.Hidai［J］.J O-cean Univ China，2007，6(1):66-71.

［11］ 孙乃霞，董庆霖，赵学明.高产虾青素红法夫酵母的选育及代谢通量分析［J］.生物加工过程，2006，4(1):54-60.

［12］ 王伟霞，李福后，浦寅芳.海洋红酵母产类胡萝卜素的研究［J］.食品研究与开发，2007，28(10):55-58.

［13］ 张超，刘军.SCP生产菌海洋红酵母摇瓶培养研究［J］.四川轻化工学院学报，2000，13(3):71-74.

［14］ 刘春巧，张淑荣，张鹏.黄单胞菌生物催化合成α-熊果苷［J］.催化学报，2006，27(4):361-364.

［15］ 张志军，江晓路，张婷婷，等.海洋红酵母Rhodotorula sp.06产类胡萝卜素的研究［J］.仪器工业科技，2007，28(11):123-125，131.