太子参中环肽Pseudostellarin A的超声提取工艺研究

吴 兵，陈 新，何 超，寇芸芸，周 艳

(武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北武汉430023)

太子参系常用中药，它为石竹科(Caryophyllaceae)异叶假繁缕属植物Pseudostellaria Heterophylla(Miq.)Pax的干燥块根，别名孩儿参、童参。全国各地均有分布，主产于福建、山东、安徽、江苏等省。具益气健脾、生浸润肺之功。用于治疗脾虚体倦，食欲不振，神经衰弱和小儿病后体力恢复，为补气药中的一味清补之品［1］。与人参功用相仿，但以“清补”见长，特点为益气但不升提，生津但不助湿，扶正却不恋邪，补虚又不均猛。主治心悸自汗，疲倦乏力，脾虚食少，气阴不足，自汗口渴，肺燥干咳等症。环肽作为一类重要的化合物，在生物医学、药学等许多方面有着可观的发展前景。太子参中的环肽成分具酪氨酸酶抑制活性［2-4］。国内外对太子参环肽Pseudostellarin A的研究集中在提取、分离和结构鉴定上［2-4］，对太子参中环肽Pseudostellarin A的含量分析和提取工艺研究尚未见报道。本文以本实验室分离、纯化所得的Pseudostellarin A(纯度为98%以上)为对照品，进行太子参Pseudostellarin A的含量测定和分析检测方法研究，在此基础上采用正交试验进行太子参Pseudostellarin A的提取工艺研究，为太子参环肽的进一步开发，提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

DIONEX高效液相色谱仪(备有单元泵、自动进样器以及UVD170U检测器)：美国戴安公司;SB-5200双频超声清洗机：宁波新芝生物科技有限公司;BUCHI旋转蒸发仪;瑞士BUCHI公司;GRACE固相萃取仪;予华SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵：巩义市予华仪器厂。

1.2 试验材料

Pseudostellarin A对照品(本实验室分离纯化所得，经液相 HPLC检测，纯度 ＞98%)，乙腈(色谱纯，科密欧公司)，试验用水为Aquapro超纯水，其他试剂为分析纯。太子参产于福建，购于武汉市同济堂药店。

1.3 实验方法

1.3.1 太子参环肽提取工艺

提取工艺见图1。

图1 太子参环肽提取工艺流程示意图

1.3.2 太子参环肽测定方法

取100 mg太子参环肽制品定容至100 mL，并从中精密吸取10 mL至10 mL的容量瓶中，HPLC法测定太子参环肽的含量。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

2.1.1 色谱条件

色谱柱为 GRACE C18(250×4.6mm)，流动相为乙腈：1‰THF水溶液(25∶75)，紫外检测波长为203nm，柱温25℃，流速为1mL·min-1，检测时间为0-15min。

2.1.2 线性关系考察

精密称取Pseudostellarin A对照品3.1mg，用色谱甲醇定容到10mL的容量瓶中。依次取5mL，2.5 mL，1.25mL，0.625mL，0.3125mL 的对照品溶液用色谱甲醇定容到10mL的容量瓶中，配制出310 μg/mL，155 μg/mL，77.5 μg/mL，38.75 μg/mL，19.375 μg/mL，9.688μg/mL 对照品溶液。根据 Pseudostellarin A的浓度和峰面积绘制标准曲线，以标准品浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，在 9.688 μg/mL—310 μg/mL，Y=0.8676X+0.1729 范围内峰面积 Y与浓度X的线性关系良好，γ=0.9999(Y=0.8676X+0.1729)。标准曲线见图2。

图2 太子参Pseudostellarin A标准曲线

2.2 提取时间对太子参环肽含量的影响

将实验温度恒定为30℃，料液比为1∶10，超声提取时间为1.5h，乙醇浓度为100%，并以此提取条件为实验的基础条件。在此基础实验条件下，选择0.5h，1h，1.5h，2h，2.5h 进行单因素实验，结果见图3。

图3 提取时间对环肽A含量的影响

实验结果表明，在其他实验条件不变的情况下，超声提取时间为1h，1.5 h，2 h时，提取液中环肽含量较大。环肽的含量开始随着提取时间的增长而逐渐增大，但当时间增大到2h时，环肽含量达到最大，随后却开始降低。

2.3 乙醇浓度对太子参环肽含量的影响

在基础实验条件下，选定 20%，50%，70%，90%，100%的乙醇溶液进行单因素实验，实验结果见图4。

图4 乙醇浓度对环肽A含量的影响

实验结果表明，在其他条件不变的条件下，在乙醇浓度为70%，90%，100%时，太子参环肽含量较高。太子参环肽含量在低浓度的乙醇提取液中含量不是很高，在高浓度的乙醇提取液中含量增加。

2.4 料液比对太子参环肽含量的影响

在基础实验条件下，选定料液‘1∶2，1∶5，1∶7，1∶12，1∶15 进行单因素实验，实验结果见图5。

图5 料液比对环肽含量的影响

实验结果表明，在其他条件不变时，在料液比为1∶7，1∶12时，环肽A的含量较大。刚开始环肽A的含量随着料液比的增加而增加，随后随着料液比的增大，环肽A的含量增加的趋势开始变得不明显。环肽A含量在开始会随着提取溶剂的增多而增加，而当浸提完全后，再增加溶剂的比例影响不显著。

2.5 太子参环肽A最佳提取工艺的确定

在单因素实验的基础上选定超声提取时间、料液比、乙醇浓度三因素为考察指标，按L9(34)正交表三因素三水平实验，从中筛选最佳的工艺条件和技术参数，结果分别见表1和表2。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验结果

根据表2可知，影响影响Pseudostellarin A浓度大小的因素显著性顺序依次为C＞A＞B，即乙醇浓度＞超声时间＞料液比。最优方案为A2B3C3，即在温度为30℃，超声时间1小时，料液比1∶15，乙醇浓度为100%时，太子参Pseudostellarin A的提取浓度最高，测得环肽A的浓度为4.8μg/g。上述实验结果见方差分析表3。

表3 方差分析表

正交试验结果表明乙醇浓度对实验结果的影响显著，且影响实验结果的显著性依次为乙醇浓度＞超声时间＞料液比。优化后的提取工艺为A2B3C3，即在温度为30℃，超声时间1小时，料液比1∶15，乙醇浓度为100%。在此条件下，太子参环肽A的提取浓度最大为 4.8 μg/g。

3 结论

目前国内外尚未报道太子参环肽Pseudostellarin A的含量测定及分析检测方法相关的研究，本实验采用HPLC法，对太子参建立了环肽Pseudostellarin A的分析检测方法，在此基础上通过正交试验得出在温度为30℃，超声时间1h，料液比1∶15，乙醇浓度为100%时，为太子参Pseudostellarin A的提取浓度最高为4.8 μg/g。本实验研究不仅建立了Pseudostellarin A的含量测定及分析检测方法，而且进行了太子参环肽Pseudostellarin A提取工艺研究，为今后Pseudostellarin A进一步的研究奠定了工作基础。

［1］ 李仕海，刘训红.江苏地产太子参中氨基酸及微量元素的分析［J］.时珍国医国药，2001，12(3)：199-200.

［2］ Hiroshi Morita，Takashi Kayashita，Hideyuki Kobata，et al.Pseudoste-llarins A-C，new tyrosinase inhibitory cyclic peptides from Pseudostellaria Heterophylla［J］.Tetrahedron，1994，50(23)：6797-6804.

［3］ Hiroshi Morita，Takashi Kayashita，Hideyuki Kobata，et al.Pseudostella-rins D-F，new tyrosinase inhibitory cyclic peptides from Pseudostellaria Heterophylla［J］.Tetrahedron，1994，50(33)：9975-9982.

［4］ Hiroshi Morita，Takashi Kayashita，Hideyuki Kobata，et al.Pseudostell-arins A，new tyrosinase inhibitorycyclic peptides from Pseudostellaria Heterophylla［J］.Tetrahedron Letters，1994，35(21)：3563-3564.