人尿中对乙酰氨基苯甲酸和N，N-二甲氨基-2-丙醇的液质联用法测定及尿药排泄特征研究

于 勇， 孙鲁宁， 杜晓琅， 饶雅琨， 丁 雯， 丁 黎*， 肖慧凤， 陈益智

(1.中国药科大学药物分析教研室，江苏南京210009;2.广州博济新药临床研究中心有限公司，广东广州510000;3.海南皇隆制药厂有限公司海南海口571127)

异丙肌苷(1)是一种抗病毒药，同时具有增强机体免疫功能的作用，临床上广泛应用于多发性口角炎、局灶性生殖器炎、亚急性硬化性全脑炎和单纯疱疹病毒感染的治疗［1-2］，且在改善艾滋病、类风湿性关节炎等免疫系统疾病病人免疫功能方面也具有一定功效［3-4］。

由分子结构可见，异丙肌苷是由肌苷、对乙酰氨基苯甲酸(PAcBA)和N，N-二甲氨基-2-丙醇(DIP)以1∶3∶3的摩尔比组成的复合物。其中肌苷为人体内源性物质，摄入一定量的肌苷，不会导致其血浆浓度发生明显变化，其主要以尿酸形式从尿液中排泄［1，5］。目前，国内外有关PAcBA和DIP的人体尿药浓度测定方法和在中国人体内的尿药排泄特征尚未见报道。本文建立了测定人尿中PAcBA的液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法和测定人尿中DIP的液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)方法，并考察了异丙肌苷片经中国健康受试者口服后PAcBA和DIP尿药浓度的经时变化过程及尿药排泄特征。

1 材料

1.1 药品和试剂

异丙肌苷片(规格:0.5 g，海南皇隆制药厂有限公司，批号:090701);PAcBA和DIP对照品(含量均大于99.0%，海南皇隆制药厂有限公司);对乙酰氨基酚(内标，中国药品生物制品检定所，批号: 100018-200408);盐酸金刚烷胺(内标，中国药品生物制品检定所，批号:100426-201002)。甲醇和乙腈均为色谱纯;醋酸铵、甲酸和乙酸乙酯均为分析纯;实验用水为去离子水。

1.2 仪器

Agilent1100液相色谱-质谱联用仪，色谱工作站为Agilent Chemstation;Agilent 1200液相色谱-串联质谱联用仪，色谱工作站为Agilent MassHunter; 1612-1型高速离心机(上海医疗器械集团有限公司);WH-3微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)。

2 方法

2.1 尿样中PAcBA的LC-MS测定方法

2.1.1 色谱条件 色谱柱:Amethyst C18-P(150 mm×2.1 mm，5μm);流动相:甲醇-0.1%甲酸水溶液(25∶75);流速:0.4 mL·min-1;柱温:35℃;进样量: 3μL。

2.1.2 质谱条件 采用气动辅助电喷雾离子化，正离子选择性离子检测(SIM)，检测对象为PAcBA的［M+H］+峰(m/z:180.1)和对乙酰氨基酚的［M+H］+峰(m/z:152.1)，裂解电压分别为110 V和150 V，干燥气流速为10 L·min-1，雾化室压力为50 psi(1 psi=6.895 kPa)，干燥气温度为350℃。

2.1.3 尿样处理 于10 mL离心管中精密加入尿样0.5 mL，加入内标对乙酰氨基酚溶液(101.7 mg·L-1) 25μL，旋涡混匀，加水5 mL稀释，取稀释液1 mL置1.5mL离心管中，以15 600 r·min-1高速离心8 min，吸取上清液转移至自动进样器样品瓶中，进行LC-MS分析。

2.2 尿样中DIP的LC-MS/MS测定方法

2.2.1 色谱条件 色谱柱:Hedera CN(150 mm×2.1 mm，5 m);流动相:乙腈-5 mmol·L-1醋酸铵水溶液(含0.03%甲酸)(55∶45);流速:0.35 mL·min-1;柱温:35℃;进样量:2μL。

2.2.2 质谱条件 采用气动辅助电喷雾离子化，正离子多反应检测(MRM)，检测离子反应为DIP离子的m/z:104.1→ 71.1和金刚烷胺离子的 m/z: 152.2→135.1，裂解电压为81 V，碰撞能量12 eV，干燥气流速为9 L·min-1，雾化室压力为40 psi，干燥气温度为350℃。

2.2.3 尿样处理 于10 mL离心管中精密加入尿样0.2 mL，内标金刚烷胺溶液(80.96 mg·L-1) 20 L，旋涡混匀，加水8 mL稀释，取稀释液0.2 mL置1.5 mL离心管中，再加水1 mL稀释，以15 600 r·min-1高速离心8 min，取上清液转移至自动进样器样品瓶中，进行LC-MS/MS分析。

2.3 临床试验方案

10名中国健康受试者，体重为49～78 kg，年龄为21～27岁，无烟酒嗜好，试验前经询问病史、体格检查和实验室检查均未发现异常，试验期间统一饮食。试验方案经辽宁中医药大学附属第二医院伦理委员会审议通过，受试者自愿参加试验并签署知情同意书。

受试者单次口服异丙肌苷片1.0 g，并于服药前及服药后0～2、2～4、4～6、6～9、9～12、12～24、24～36 h各时间段收集所有尿液，记录各时间段尿液总体积后取其适量于-70℃保存待测。

2.4 尿药排泄参数计算方法 各时间段的尿药浓度测定值与相应时间段尿液总体积相乘得各时间段药物排泄量，其与相应时间段时间长度之比为各时间段药物排泄速率;各时间段药物排泄量之和为药物累积排泄量，其与给药剂量之比即为相应时间内的药物累积排泄百分率。

3 结果

3.1 尿样中PAcBA的LC-MS测定方法评价

3.1.1 方法专属性 按“2.1.1”和“2.1.2”项下的色谱和质谱条件，取经“2.1.3”项下方法处理的空白尿样(不加内标)、加入PAcBA和内标的空白尿样及受试者服药后尿样进样，记录色谱图(见图1)。

图1 LC-MS专属性试验色谱图Figure 1 Chromatograms of LC-MS specificity test for PAcBA

由图1可见，PAcBA和内标峰形良好，内源性物质无干扰，PAcBA和内标的保留时间分别约为5.1和2.1 min。

3.1.2 尿样中PAcBA标准曲线制备及定量下限取若干份空白尿样，分别加入适量PAcBA标准溶液(用PAcBA对照品和甲醇配制)，旋涡混匀，制得质量浓度为 0.202 0、1.010、5.050、20.20、60.60、121.2、202.0 mg·L-1的标准含药尿样，按“2.1.3”项下方法处理，进样，记录色谱图。以PAcBA峰面积(As)与内标峰面积(Ai)的比值f(f=As/Ai)对尿药浓度(C)作权重回归计算，得回归方程:f= 0.074 4 C-0.002 0，r=0.998 7，权重系数 w= 1/C2。结果显示，PAcBA尿药浓度在 0.202 0～202.0 mg·L-1范围内线性关系良好，最低定量限为0.202 0 mg·L-1。

3.1.3 精密度和准确度 同法配制并处理质量浓度为0.505 0、10.10、171.7 mg·L-1的PAcBA标准含药尿样，每个浓度平行5份，进样测定，每天1批，连续测定3批，同时制备随行标准曲线。将所测数据进行方差分析，计算精密度(RSD)和准确度［相对偏差(RE)］，结果显示方法精密度和准确度良好(见表1)。

表1 PAcBA检测的精密度和准确度试验结果(n=15)Table1 Result of precision and accuracy test for PAcBA

3.1.4 回收率和介质效应 同法配制并处理质量浓度为0.505 0、10.10、171.7 mg·L-1的PAcBA标准含药尿样，每个浓度平行5份，作为回收率样品;另取5个不同来源空白尿样同法处理，取上清液，加入PAcBA和内标标准溶液，配制同上3个质量浓度的标准含药尿样，每个浓度平行5份，作为介质效应样品和回收率对照样品;以水代替尿样同法配制并处理同上3个质量浓度的PAcBA标准液，每个浓度平行3份，作为介质效应对照样品。将上述各样品进样，记录色谱图，回收率和介质效应样品峰面积与相应对照品峰面积均值之比即为回收率和介质效应值。结果测得，PAcBA的回收率分别为(98.7± 2.6)%、(97.7±2.2)%和(98.8±1.6)%(n= 5)，介质效应分别为(97.1±2.7)%、(99.2±2.9) %和(99.8±1.8)%(n=5);内标的回收率和介质效应分别为(99.0±2.1)%和(98.2±3.9)%(n= 15)。可见，尿样中PAcBA和内标的回收率均良好，尿样基质对其离子化及测定无影响。

3.1.5 稳定性考察 同法配制质量浓度为0.505 0、10.10、171.7mg·L-1的PAcBA标准含药尿样若干份。其中3份经同法处理后立即进样测定或于进样器放置11.5 h后再进样测定;另取3份反复冻融3次，3份室温放置10 h，3份于-20℃下冰冻5周，3份于-20℃下冰冻12周，然后将这12份尿样同法处理，进样测定。结果显示，尿样中PAcBA的稳定性良好(见表2)。

表2 尿样中PAcBA的稳定性试验结果(n=3)Table2 Result of stability test for PAcBA in urine

3.2 尿样中DIP的LC-MS/MS测定方法评价

3.2.1 方法专属性 按“2.2.1”和“2.2.2”项下的色谱和质谱条件，将经“2.2.3”项下方法处理的空白尿样(不加内标)、加入DIP和内标的空白尿样及受试者服药后尿样进样，记录色谱图(见图2)。

图2 LC-MS/MS专属性试验色谱图Figure 2 Chromatograms of LC-MS/MS specificity test for DIP

由图2可见，DIP和内标峰形良好，内源性物质无干扰，DIP和内标的保留时间分别约为2.4和1.8 min。

3.2.2 尿样中DIP标准曲线制备及定量下限 取若干份空白尿样，分别加入适量DIP标准溶液(用DIP对照品和甲醇配制)，旋涡混匀，制得质量浓度为 0.797 8、3.191、11.97、39.89、119.7、239.4、398.9 mg·L-1的标准含药尿样，按“2.2.3”项下方法处理，进样，记录色谱图。以DIP峰面积(As)与内标峰面积(Ai)的比值 f(f=As/Ai)对尿药浓度(C)作权重回归计算，得回归方程:f=0.025 5 C+0.002 3，r=0.999 6，权重系数w=1/C2。结果显示，DIP尿药浓度在0.797 8～398.9 mg·L-1范围内线性关系良好，最低定量限为0.797 8 mg·L-1。

3.2.3 精密度和准确度 同法配制并处理质量浓度为1.995、39.89、339.1mg·L-1的DIP标准含药尿样，每个浓度平行5份，进样测定，每天1批，连续测定3批，同时制备随行标准曲线。将所测数据进行方差分析，计算精密度和准确度，结果显示方法精密度和准确度良好(见表3)。

表3 DIP检测的精密度和准确度试验结果(n=15)Table3 Result of precision and accuracy test for DIP

3.2.4 回收率和介质效应 同法配制并处理质量浓度为1.995、39.89、339.1mg·L-1的DIP标准含药尿样，每个浓度平行5份，作为回收率样品;另取5个不同来源空白尿样同法处理，取上清液，加入DIP和内标标准溶液，配制同上3个质量浓度的标准含药尿样，每个浓度平行5份，作为介质效应样品和回收率对照样品;以水代替尿样同法配制并处理同上3个质量浓度的DIP标准液，每个浓度平行3份，作为介质效应对照样品。将上述各样品进样，记录色谱图，回收率和介质效应样品峰面积与相应对照品峰面积均值之比即为回收率和介质效应值。结果测得，DIP的回收率分别为(99.1±3.9)%、(99.1±2.4)%和(99.9±1.4)%(n=5)，介质效应分别为(94.1±1.1)%、(95.1±0.3)%和(98.6±1.4)%(n=5);内标的回收率和介质效应分别为(99.7±1.3)%和(97.4±2.2)%(n= 15)。可见尿样中DIP和内标的回收率均良好，尿样基质对其离子化及测定无影响。

3.2.5 稳定性考察 同法配制质量浓度为1.995、39.89、339.1 mg·L-1的DIP标准含药尿样若干份。其中3份经同法处理后立即进样测定或于进样器放置6.5 h后再进样测定;另取3份反复冻融3次，3份室温放置7 h，3份于-80℃下冰冻4周，3份于-80℃下冰冻10周，然后将这12份尿样同法处理，进样测定。结果显示，尿样中DIP的稳定性良好(见表4)。

表4 尿样中DIP的稳定性试验结果(n=3)Table4 Result of stability test for DIP in urine

3.3 人体尿药排泄特征

10名中国健康受试者按“2.3”项下方案服用异丙肌苷片后，收集各时间段尿液，分别按“2.1”和“2.2”项下方法测定PAcBA和DIP尿药浓度，按“2.4”项下方法计算尿药排泄参数，绘制尿样中PAcBA和 DIP的平均尿药排泄速率-时间曲线(见图3)及PAcBA和DIP的平均尿药累积排泄百分率-时间曲线(见图4)。

图3 PAcBA和DIP的平均尿药排泄速率－时间曲线Figure 3 Average excretion rate-time curve of PAcBA and DIP in urine

由图3可见，PAcBA和DIP均在0～2 h时间段的尿药排泄速率最大，且分别在6和12 h后基本排泄完全。由图4可见，在36 h内，分别有占给药剂量(30.7±5.7)%和(49.0±8.6)%的PAcBA和DIP从尿中排出。

4 讨论

PAcBA和DIP在尿样中浓度较高，本文采用直接稀释法处理尿样，操作简便，回收率高，无基质干扰，亦可避免质谱饱和［6］。笔者曾考虑采用LC-MS法同时测定PAcBA和DIP，但由于两者的质谱响应不一样，PAcBA的质谱响应要远小于DIP，而两者的尿药浓度又相近，测定时稀释倍数难以一致，且DIP为小分子极性物质，在C18柱上几乎无保留，故本文采用C18柱测定PAcBA，且流动相中不加醋酸铵，以增强其质谱响应，而采用正相色谱柱测定DIP，以期使其获得较好的色谱保留。而且，笔者先后尝试采用HILIC柱、氨基柱等正相色谱柱测定DIP，结果发现，当存在较严重的基质效应，尿样中内源性杂质难以洗脱［7-8］，故最终选用氰基柱;同时，还曾考察了流动相中不同酸量对DIP色谱保留和质谱响应的影响，结果发现，当流动相中不加酸、只加醋酸铵时，DIP色谱保留很强，且响应较弱，而加入0.1%的甲酸时，DIP则几乎在死时间出峰，故最终选用乙腈-5 mmol·L-1醋酸铵水溶液(含0.03%甲酸)(55∶45)作为流动相，致使DIP和内标获得适当的保留时间，且其尿样稀释200倍后测定，响应仍良好，无基质干扰。试验结果表明:本文建立的LC-MS和LC-MS/MS方法适用于尿样中PAcBA与DIP的测定，且快速、灵敏、准确。

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