曲古菌素A对FcεRI介导的肥大细胞活化的影响

王庆辉，吕昌龙*，单风平，刘军

(1.中国医科大学基础医学院免疫学教研室，辽宁沈阳110001;2.中国医科大学免疫研究所，辽宁沈阳110001)

抗变应原的特异性抗体IgE与肥大细胞表面表达的IgE高亲合力受体FcεRI交联，形成IgE/FcεRI复合物，活化肥大细胞。进而活化的肥大细胞通过释放其储存的组胺等生物活性介质或者新合成的TNF-α、IL-6和IL-13等细胞因子，引发变态反应的发生。基因表达调控与染色体上组蛋白乙酰化的状态有关。这种状态受控于2种关键的调节因子，即组蛋白乙酰化酶(Histone acetyltransferase，HAT)和组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase，HDAC)。HAT和HDAC通过转移或者移除位于组蛋白NH2端的赖氨酸残基的乙酰基，而实现对某一基因的转录调控。在正常情况下，HAT和HDAC的调控作用处于平衡状态，一旦细胞发生转化，这种平衡被打破，一些细胞增殖和细胞周期的相关调控分子表达失衡，进而导致细胞癌变［1］。近年来，曲古菌素A(Trichostatin A，TSA)作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylase inhibitors，HDACi)，能够抑制肿瘤细胞的生长，或者诱导肿瘤细胞的分化和凋亡［2-4］，而成为新一代抗癌制剂;还可通过调节各种基因的表达，纠正系统性红斑狼疮［5-6］、类风湿性关节炎［7］等免疫性疾病的免疫失衡。特别是在变态反应性哮喘的小鼠模型中，TSA通过减少Th2型细胞因子分泌以及支气管肺泡灌洗液中IgE的表达，减轻过敏性气道炎症反应，显示了潜在的治疗效应［8］。然而，TSA是否能够影响变态反应的重要效应细胞—肥大细胞的活化，却鲜有报道。为此，本实验体外观察曲古菌素A对FcεRI诱导小鼠骨髓来源的肥大细胞活化的影响，旨在为肥大细胞相关的变态反应的研究提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物6～8周龄，雌性，BALB/c小鼠(本校实验动物部提供)。

1.1.2 主要试剂TSA(Sigma);RPMI 1640培养基(Thermo);FCS(Biological Industries，Haemek，Israel);PWM刺激的脾细胞培养上清(本实验室制备);Tyrode’s缓冲液;Triton;p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucopyranoside(Sigma);小鼠IgE、小鼠anti-IgE抗体(eBioscience);2.4G2(PharMingen);小鼠PE-anti FcεRI抗体(MAR-1，eBioscience);小鼠FITC-anti c-kit抗体(Pharmingen);propidium iodide(PI)、Annexin V-FITC(BD Biosciences);IL-6、TNF-α和IL-13 ELISA试剂盒(R＆D Systems，Minneapolis，MN)。

1.1.3 主要仪器FACSCalibur流式细胞仪(Becton-Dickinson，Franklin Lakes，N.J.，USA);酶标仪(InterMed NJ-2100);CO2孵箱(Harasawa，Japan)。

1.2 方法

1.2.1 骨髓来源的肥大细胞(bone marrow-derived mast cells，BMMC)的制备BALB/c小鼠，雌性，6～8周龄。无菌钝性分离小鼠双侧股骨，用1 mL注射器吸取少量RPMI-1640培养液冲洗股骨骨髓内细胞至无菌平皿中。收集细胞至10 mL离心管中，1 000 r/min，4℃离心5 min，弃上清。用10 mL BMMC培养液(含10%PWM刺激的脾细胞培养上清的10%FCS-RPMI 1640培养液)重悬细胞，移至10 cm无菌培养皿，于37℃，5%CO2孵箱孵育。常规换液，培养4周后待用［9］。

1.2.2 ELISA试剂盒检测细胞因子调制小鼠BMMC浓度至1×106/mL，于50 nmol/L TSA 37℃，5%CO2孵箱孵育24 h。细胞经1 μg/mL IgE于4℃致敏1 h之后，再经1 μg/mL anti-IgE抗体于37℃，5%CO2孵箱孵育3 h(TNF-α)或6 h(IL-6和IL-13)，同时设未加anti-IgE抗体的阴性对照孔。收集培养上清，按照ELISA试剂盒说明书操作步骤分别检测培养上清中TNF-α、IL-6和IL-13的分泌水平，每份标本设3个复孔。用酶标仪测定样本OD450值。以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线，计算细胞因子含量(pg/mL)。

1.2.3 脱颗粒检测50 nmol/L TSA孵育的并经1 μg/mL IgE致敏的1×106/mL小鼠BMMC重悬于Tyrode’s缓冲液中，经1 μg/mL anti-IgE抗体37℃刺激45 min后，收集上清液。加入p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucopyranoside作为底物37℃显色90 min，经酶标仪测定OD405值(ODsample)。IgE致敏细胞经2%Triton处理的培养上清液的OD值作为细胞颗粒的最大释放量(ODtotal)。IgE致敏细胞经Typrode’s缓冲液孵育的上清液的OD值为ODbase。β-氨基己糖苷酶的释放量(%)=(ODsample－ODbase)/(ODtotal－ODbase)×100%。

1.2.4 流式细胞仪(FACS)检测收集BMMC，经2.4G2阻断细胞表面Fc受体后，与小鼠PE-anti FcεRI抗体和小鼠FITC-anti c-kit抗体4℃避光孵育1 h，PBS洗细胞2遍，用FACSCalibur流式细胞仪分析细胞表面FcεRI和c-kit表达，鉴定肥大细胞的纯度。BMMC经50 nmol/L TSA于37℃孵育24 h或48 h。24 h后收集细胞，经2.4G2封闭，加入PE-anti FcεRI抗体，4℃避光孵育1 h，PBS洗细胞后，FACSCalibur流式细胞仪分析细胞表面FcεRI表达;48 h后收集细胞，经5 μg/mL propidium iodide(PI)和Annexin V-FITC室温染色15 min，FACSCalibur流式细胞仪分析BMMC的凋亡。

2 结果与分析

2.1 肥大细胞的表型鉴定

小鼠骨髓细胞培养4周后，经流式细胞仪检测，大于95%的细胞表达成熟肥大细胞的特异性表型(FcεRI+/c-kit+)，提示细胞已培养为成熟的BMMC(见图1)。

图1 BMMC特异性表面分子的表达Fig.1 The expressions of specific markers on BMMC

图2 TSA对BMMC脱颗粒的影响Fig.2 The effect of TSA on the degranulation of BMMC

2.2 TSA对IgE交联诱导肥大细胞脱颗粒的影响

FcεRI介导活化的肥大细胞可迅速释放组胺等生物活性介质。由于β-氨基己糖苷酶与组胺的释放呈一致性，因此，常被用来检测肥大细胞脱颗粒能力。小鼠BMMC分别经50 nmol/L TSA 37℃孵育24 h后，经1 μg/mL IgE/anti-IgE体外刺激，并检测细胞β-氨基己糖苷酶的释放量。结果显示，未经TSA孵育的BMMC的β-氨基己糖苷酶的释放可达到(50.44±1.63)%，TSA孵育后，BMMC β-氨基己糖苷酶的释放显著被抑制(图2)，表明TSA可降低FcεRI介导的BMMC脱颗粒能力。

2.3 TSA对IgE交联诱导肥大细胞分泌细胞因子的影响

如表1所示，正常小鼠BMMC经1 μg/mL IgE/anti-IgE体外刺激后，培养上清中TNF-α、IL-6和IL-13的分泌显著升高(Control组)，表明IgE/anti-IgE刺激可诱导肥大细胞分泌炎性细胞因子;而经TSA孵育后，IgE/anti-IgE刺激诱导BMMC分泌TNF-α、IL-6和IL-13的能力显著降低，提示TSA可抑制小鼠FcεRI介导活化的BMMC分泌炎性细胞因子。

2.4 TSA对肥大细胞FcεRI表达的影响

小鼠BMMC经50 nmol/L TSA 37℃孵育24 h后，FACS检测细胞表面FcεRI的表达。结果显示，与未经TSA孵育的BMMC相比，TSA孵育后的BMMC FcεRI平均荧光强度显著降低(图3)，表明TSA可抑制肥大细胞FcεRI的表达。

图3 TSA对BMMC FcεRI表达的影响Fig.3 The effect of TSA on the expression of FcεRI on BMMC

图4 TSA对肥大细胞凋亡的影响Fig.4 The effect of TSA on the apoptosis of BMMC

2.5 TSA对肥大细胞凋亡的影响

如图4所示，50 nmol/L TSA孵育48h后，Annexin V-FITC+/PI-细胞即凋亡细胞的比例明显增加，提示TSA可诱导肥大细胞凋亡。

表1 TSA对FcεRI介导的BMMC分泌细胞因子的影响Table 1 Effect of TSA on the productions of cytokines from FcεRI-mediated BMMC

3 讨论

目前，变态反应患者的数量在全世界范围内与日俱增。变应原诱导机体产生特异性抗体IgE，形成抗原抗体复合物，进而与肥大细胞表面FcεRI交联，活化肥大细胞，并促使其释放生物活性介质，是引发变态反应的关键环节。因此，以变态反应的效应细胞—肥大细胞为靶点，研制调控肥大细胞活化的相关制剂，是控制变态反应性疾病发生和进展的重要手段之一。报道显示，组蛋白去乙酰化酶抑制剂—TSA在过敏性疾病和炎症性疾病过程中发挥一定作用［8］。然而，TSA对肥大细胞的影响却鲜有报道。本实验结果显示TSA可抑制FcεRI-介导的小鼠BMMC活化。

经IgE/FcεRI交联活化的BMMC可迅速释放组胺等颗粒性物质，并合成炎症性细胞因子，发挥其生物学功能。然而，经50 nmol/L TSA孵育后，FcεRI-介导的BMMC的脱颗粒(图2)以及合成分泌TNF-α、IL-6和IL-13等炎性细胞因子(表1)的能力显著下降。据报道，TSA能够选择性地诱导包括P815肥大细胞瘤在内的多种肿瘤细胞的凋亡［10］，一致的是，本实验TSA处理后的BMMC FcεRI表面表达降低(图3)，凋亡细胞数增加(图4)，由此提示TSA同样可以诱导正常小鼠肥大细胞的凋亡，下调FcεRI表达，继而使BMMC活化受到抑制。本实验结果为TSA在肥大细胞相关的超敏反应性疾病中的应用提供了实验数据。然而，TSA作用于肥大细胞凋亡和/或FcεRI活化信号路径上的确切的分子靶位还有待进一步研究。

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