类胡萝卜素产生菌种的鉴定

刘卉琳，刘绍，2，兰时乐，谢达平*

(1.湖南农业大学生物安全与技术学院，湖南长沙410128;2.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙410128;3.湖南农业大学生命科学技术学院，湖南长沙410128)

类胡萝卜素是碳氢化合物及其氧化衍生物两大类色素的总称。它具有多种功能，从最原始的光合作用到抗氧化剂、维生素A的前体物质，它在化学、医疗以及食品和饲料添加剂上的重要价值普遍受到关注［1］。于人工生产而言，类胡萝卜素主要通过化学合成法、植物提取法和微生物发酵法得到。化学合成法生产类胡萝卜素存在一些缺点:合成技术复杂、影响食品的口味、人体吸收比例较少以及存在一定副作用［2-3］;植物提取法获得类胡萝卜素存在受季节限制、产量较低、成本较高的劣势。因此，近年来，人们对微生物生产类胡萝卜素进行了大量的研究。截止目前人类已经发现能够产生类胡萝卜素的微生物有细菌、藻类和真菌等。酵母菌的经典鉴定方法主要依赖其形态学和生理生化特征反应，但由于酵母菌属种菌落形态相似，主要以单细胞形式存在，且细胞形状接近，通过形态特征观察依据不充分;菌落在长期培养或变异后产生新的突变株及同化碳源、氮源等化合物的能力，因此只靠生理生化特征作为种间鉴别依据也并不完全可靠［4-6］。随着当代生命科学的发展，rRNA基因的序列分析被越来越多地应用于酵母菌的分类研究中。本研究通过定性分析，常规分类方法，按照形态学和生理生化特征将从福建红酒酒糟中分离出的产类胡萝卜素的菌株进行初步分类，结合分子分类学，利用26S rDNA D1/D2区域的碱基序列分析法对该菌株进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种从福建红酒酒糟中分离出来的编号为B-5的产色素的菌株，由湖南农业大学生物科技学院微生物实验室保藏。

1.1.2 培养基大米半合成培养基:大米8 g，水20 mL，葡萄糖0.2 g;麦芽汁培养基、马铃薯培养基、Gorodkowa培养基、葡萄糖发酵培养基、同化碳源培养基、硝酸钾培养基、50%葡萄糖-酵母膏琼脂培养基、产类淀粉化合物培养基等的配制参照文献［7］进行。

1.2 方法

1.2.1 色素的鉴定挑取活化菌株，接种于大米半合成培养基上，28℃下培养3 d，将发酵产物干燥后称取1 g，加入丙酮20 mL，于超声波下破碎1 h，离心取上清液即得色素粗提液。将初提液进行波长扫描，并参照文献［8］进行鉴定。

1.2.2 形态学特征鉴定参照文献［7］进行鉴定。①细胞形态学观察:取待鉴定菌株接种培养，转接至麦芽汁培养基中，28℃下培养3 d，镜检，观察细胞形态和无性繁殖方式;②培养特征:取待鉴定菌株接种培养，转接至麦芽汁培养基和5%麦芽汁固体平板上，28℃下培养3 d，观察液体培养液是否有浮膜、环及沉淀物。固态培养基中观察菌落色泽、质地、表面是否有褶皱及边缘形状;③子囊孢子的形成和形态:取待鉴定菌株接种培养，转接至马铃薯培养基和Gorodkowa培养基，28℃培养3～5 d，涂片观察子囊孢子形态及孢子数;④假菌丝的形成和形态:取待鉴定菌株接种培养，用新鲜培养物划线接种至马铃薯培养基，盖上灭菌盖片，28℃培养3～5 d，低倍镜观察盖片下划线两旁是否形成假菌丝。

1.2.3 生理生化特征鉴定参照文献［7］进行鉴定。①葡萄糖发酵试验:取葡萄糖发酵培养基，接入培养好的菌液1 mL，28℃下培养，7 d内杜氏管内如有产气现象，认为可以发酵葡萄糖;②碳源同化试验:生长图谱法［9］;③氮源同化试验:分别接种新鲜培养物于0.78%硝酸钾的培养基内，28℃培养2 d，观察是否同化硝酸钾情况;④耐高渗透压试验:取新鲜培养物接种至50%葡萄糖-1%酵母膏溶液的琼脂培养基中，28℃培养1～2周，观察菌种生长情况;⑤产类淀粉化合物试验:在产类淀粉化合物培养基上划线接入待鉴定菌株，28℃培养1～2周，表面滴卢氏碘液1滴，观察菌落情况，如菌落周围呈现蓝色，即为“+”;⑥37℃生长试验:取待鉴定菌株接种至麦芽汁培养基中，37℃培养3～5 d，观察菌种生长情况。

1.2.4 分子生物学鉴定①酵母总DNA的提取:参照文献［10］进行提取;②PCR引物的设计与扩增［6］:根据酵母基因组26S rDNA D1/D2区序列设计一对简并特异引物:NL-1/NL-4，由上海Invitrogen生物公司合成。正向引物NL-1:5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'，反向引物NL-4:5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。PCR反应条件:94℃预变性3 min，94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，30次循环;4℃保存;③PCR产物的测序:将PCR扩增的目的片段回收、纯化，产物送上海英骏生物技术公司测序，将测序结果输入www.NCBI.nlm.nih.gov，利用BLAST软件，将测得的基因序列与GenBank数据库的序列进行同源性比较。

2 结果与分析

2.1 色素鉴定

色素粗提液经扫描得到最大吸收峰在波长450 nm左右。色素的乙醚溶液加入浓硫酸后，发生蓝绿色反应，色素在吸收光谱和化学性质上与类胡萝卜素相符，该色素为类胡萝卜素。

2.2 形态学特征

待测菌株为单细胞，呈卵圆形，芽殖;在液体培养基中，1 d左右出现混浊，随着时间增加，有沉淀产生;在固体培养基上，菌落呈深红色，菌落表面湿润、粘稠，边缘整齐，易被挑起;无子囊孢子;无假菌丝形成。

图1 B-5菌株形态图Fig.1 The morphological characteristic of the B-5 strain

2.3 生理生化特征

为进一步鉴定该菌株所属类型，进行生理生化鉴定试验。葡萄糖发酵试验结果为阴性，说明该菌株不能发酵葡萄糖。碳源同化试验结果见表1。氮源同化试验结果为阳性，说明该菌株能同化硝酸钾。耐高渗试验结果为阴性。产类淀粉化合物试验结果为阴性。37℃生长试验结果为阳性。结合形态学特征与6种生理生化特征分析，对照酵母菌鉴定手册，结果表明，该菌株属于红酵母属(Rhodotorula)。

2.4 26SrDNA鉴定结果

将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，结果显示，供试酵母可扩增出1条600 bp左右的特异条带。将PCR产物测序结果输入NCBI网站进行同源性比对分析，GenBank登录号:EU285542，26S rDNA的D1/D2区域序列比对结果表明待测酵母菌与粘性红圆酵母(Rhodotorula mucilaginosa)完全一致，说明待测酵母菌为粘性红圆酵母。

表1 碳源同化试验结果Table 1 The results of sugar sources assimilation test

图2 B-5菌株的PCR扩增产物电泳图Fig.2 Electrophoresis of PCR product of the B-5 strain

3 讨论

从福建酒糟中分离的菌株所产色素为类胡萝卜素。据形态特征与生理生化鉴定结果可知，该产色菌株属于红酵母属，进一步进行分子鉴定，26S rDNA的D1/D2区域序列比对结果表明待测酵母菌与粘性红圆酵母(Rhodotorula mucilaginosa)完全一致，说明该菌株为红酵母属粘性红圆酵母。该酵母来源于酒糟，属于食品加工中安全菌种，可作为类胡萝卜素生产菌株选育的出发菌株。国内外关于粘性红圆酵母产类胡萝卜素的报道不多，因此为进一步研究粘性红圆酵母的诱变、改良和提高其类胡萝卜素产率具有一定的价值。

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