Sigma B对单核细胞增生李斯特菌耐受抗生素作用的影响

王莉，冯飞飞，张强，冯晓琴，尹晓蛟，罗勤

(华中师范大学生命科学学院遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室，湖北武汉430079)

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，简称单增李斯特菌)，是人畜共患传染病李斯特菌病(listeriosis)的主要病原菌［1］，能引起人和动物脑膜炎、败血症、流产等症状，是WHO公布的四大食源性致病菌之一［2］。临床上主要用β-内酰胺类(盘尼西林青霉素，氨苄青霉素)抗生素来治疗患者［3］。近20年来抗生素在临床上的滥用，使病原细菌的耐药性已成为严重的医学问题，即使是一向被认为对抗生素敏感的单增李斯特菌，也表现出对不同种类和不同作用机理的抗生素，如青霉素、利福平、硫酸庆大霉素、四环素盐酸和红霉素等常用抗生素多重耐药的趋势［4］。但是，目前国内外关于该菌耐药机制方面的研究较少，仅有的报道也集中于作用位点在单增李斯特菌细胞壁的抗生素，如盘尼西林青霉素和氨苄青霉素等作用的分子机理上［5］，而对其他抗生素的作用，迄今为止尚未见相关报道。Sigma B(σB)是许多革兰阳性菌对环境胁迫产生应答反应的主要调控因子［6］。已有文献显示σB在枯草芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌中，对多种抗生素产生耐药性方面都具有重要的作用［7-8］，但在单增李斯特菌中σB是否也具有同样功能，目前尚未见报道。本文通过比较单增李斯特菌标准菌株EGDe和其σB缺失株菌株EGDeΔsigB对盘尼西林青霉素、氨苄西林青霉素、利福平、硫酸庆大霉素、四环素盐酸和红霉素6种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)以及检测这2种菌株在1×MIC、2×MIC和8×MIC的氨苄西林青霉素、红霉素和利福平3种抗生素中的生长活性，研究σB在单增李斯特菌耐受抗生素中的作用，以期为深入研究革兰阳性食源性致病菌的致病机理、预防和治疗细菌感染提供新的思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株单核细胞增生李斯特菌标准菌株EGDe为德国维尔茨堡大学微生物系Werner Goebel教授馈赠;EGDeΔsigB为本实验室构建保存。

1.1.2 试剂噻唑蓝(MTT)(Sigma公司):溶解于PBS(pH 7.2)配制成5 mg/mL溶液，过滤除菌，4℃避光保存;SDS促溶剂:1.0 g SDS(Sigma公司)溶于50 mL蒸馏水中(加热溶解)以无水乙醇补充至250 mL;抗生素溶解于双蒸水或者无水酒精中配制成母液，过滤除菌，－20℃保存;盘尼西林青霉素、氨苄西林青霉素、利福平，均为Sigma公司产品;硫酸庆大霉素、四环素盐酸、红霉素均为Amresco公司产品;BHI培养基(Brain Heart Infusion)购自B＆D公司;二甲基亚砜为Promoter公司产品。其他化学试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 EGDe和EGDeΔsigB MIC的测定参照药品微生物学检验手册［9］提供的方法进行:挑取待测菌株的单个菌落接种于BHI液体培养基中，37℃、150 r/min振荡培养过夜，然后以1∶100的比例将菌液转入新鲜的BHI培养基中继续培养，待其OD600达到0.5时，将菌液加入到含有倍比稀释的抗生素的培养基中，使其终浓度为105个/mL，继续振荡培养18 h。MIC的确定:以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为待测菌的MIC。

1.2.2 MTT比色法［10］检测细菌的生长活性

MTT检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。在一定的浓度范围内，甲瓒生成量与活细菌数目成线性相关，即甲瓒的浓度越高表示活细胞越多。甲瓒可用二甲亚砜及促溶剂溶解，并通过酶标仪测定其光吸收值，间接反映活细胞数量。本实验分别挑取EGDe和EGDeΔsigB的单个菌落接种于BHI液体培养基中，37℃、150 r/min振荡培养过夜，然后以1∶100的比例将菌液转入新鲜的BHI培养基中继续培养，待其OD600达到0.4时加入抗生素。以加入抗生素时记时为0，每隔固定时间，取菌液200 μL加40 μL MTT，37℃温育30 min，5 000 r/min离心2 min，去上清，加100 μL二甲亚砜震荡10 s后，加40 μL SDS促溶剂充分混匀，然后加1倍的95%乙醇混匀稀释。测试液转移到96孔板，每孔200 μL，酶标仪(美国BIO-TEK公司)测定570 nm波长的吸光值，采用Origin 5.0统计软件绘制细菌的生长曲线。

2 结果与分析

2.1 EGDe和EGDeΔsigB对6种抗生素的MIC

如表1所示，EGDe对盘尼西林青霉素、四环素盐酸和硫酸庆大霉素的MIC高于EGDeΔsigB，2种菌株的MIC依次分别0.16和0.08 μg/mL，0.25和0.125 μg/mL，以及0.5和0.125 μg/mL;而对氨苄西林青霉素、红霉素和利福平的MIC 2种菌株没有差别，分别为0.19、0.125和0.032 μg/mL。为了进一步研究σB在单增李斯特菌耐药性中的作用，利用MTT法检测比较了EGDe和EGDeΔsigB在后3种抗生素中的生长活性。

表1 EGDe和EGDeΔsigB对6种抗生素的MICTable 1 MICs of six antibiotics against EGDe and EGDeΔsigB

2.2 MTT法检测EGDe和EGDeΔsigB在氨苄西林青霉素、红霉素和利福平3种抗生素中的生长活性

2.2.1 EGDe和EGDeΔsigB在氨苄西林青霉素中的生长活性如图1所示，与未加抗生素的EGDe和EGDeΔsigB的生长相比，当加入氨苄西林青霉素后，EGDe和EGDeΔsigB的生长立即出现迟滞现象，活细胞量减少，生长曲线呈下降趋势;经过一段时间的适应后，耐药的细菌细胞恢复生长，曲线上升。EGDe和EGDeΔsigB迟滞程度以及解除迟滞、恢复生长所需的时间与加入的抗生素浓度均呈正相关。如1×MIC(0.19 μg/mL)的氨苄西林青霉素对EGDe的生长只有微弱的抑制作用，其生长曲线几乎和未加抗生素时一致(图1A);而2×MIC(0.38 μg/mL)的氨苄西林青霉素对EGDe的生长具有明显的抑制作用(图1B);当加入8×MIC(1.52 μg/mL)的氨苄西林青霉素时，其迟滞程度达到最大(图1C)。与EGDe相比，EGDeΔsigB对加入的抗生素的作用更为敏感，当加入1×MIC(0.19 μg/mL)的氨苄西林青霉素时，其生长就出现较为明显的迟滞，而且随抗生素浓度升高，迟滞程度也比EGDe更为显著，表明单增李斯特菌抵抗氨苄西林青霉素的抑制从而恢复生长的能力依赖于sigB基因。由此可见，sigB基因的编码蛋白σB在单增李斯特菌耐受氨苄西林青霉素中具有重要作用。

图1 MTT法比较EGDe和EGDeΔsigB在1×MIC(A)、2×MIC(B)和8×MIC(C)的氨苄西林青霉素中的生长活性Fig.1 Comparison of the growth activities of EGDe and EGDeΔsigB treated with 1×MIC(A)，2×MIC(B)and 8×MIC(C)of ampicillin，as well as untreated controls in the same diagram

2.2.2 EGDe和EGDeΔsigB在红霉素中的生长活性图2显示的是EGDe和EGDeΔsigB在红霉素中的生长曲线，其结果和这2种菌株在氨苄西林青霉素中的生长趋势基本一致，即:当加入红霉素后，EGDe和EGDeΔsigB的生长立即出现迟滞现象，而且迟滞程度以及解除迟滞、恢复生长所需的时间与加入的抗生素的浓度均呈正相关;同时，与EGDe相比，EGDeΔsigB对加入的抗生素的作用更为敏感，迟滞程度也比EGDe更为显著。该结果表明单增李斯特菌抵抗红霉素的抑制从而恢复生长的能力也依赖于sigB基因。σB在单增李斯特菌耐受红霉素作用中具有重要作用。

图2 MTT法比较EGDe和EGDeΔsigB在1×MIC(A)、2×MIC(B)和8×MIC(C)的红霉素中的生长活性Fig.2 Comparison of the growth activities of EGDe and EGDeΔsigB treated with 1×MIC(A)，2×MIC(B)and 8×MIC(C)of erythromycin，as well as untreated controls in the same diagram

2.2.3 EGDe、EGDeΔsigB在利福平中的生长活性图3显示的是EGDe和EGDeΔsigB在利福平中的不同生长活性。与在氨苄西林青霉素(图1)和红霉素(图2)中的生长曲线相比，尽管EGDe和EGDeΔsigB对利福平的作用均很敏感，1×MIC(0.032 μg/mL)的利福平就能显著抑制2种菌株的生长活性(图3A)，但同浓度的利福平作用下，EGDeΔsigB被抑制的程度比EGDe更深，解除迟滞时间、恢复生长所需的时间更长，显示单增李斯特菌抵抗利福平的抑制从而恢复生长的能力依然依赖于sigB基因，表明σB在单增李斯特菌耐受利福平作用中具有重要作用。

图3 MTT法比较EGDe和EGDeΔsigB在1×MIC(A)、2×MIC(B)和8×MIC(C)的利福平中的生长活性Fig.3 Comparison of the growth activities of EGDe and EGDeΔsigB treated with 1×MIC(A)，2×MIC(B)and 8×MIC(C)of rifampicin，as well as untreated controls in the same diagram

3 讨论

近几年的研究表明，食源性致病菌单增李斯特菌出现了耐药性不断增强的趋势。自1988年首次报道了对四环素的1株耐药株后，不断从食品、环境、临床等分离到多株耐受一或者多种抗生素的单增李斯特菌耐药株［11-14］。而对于作为治疗李斯特菌病的主要药物—青霉素来说，其耐药性更是明显增强:2001年，Walsh等［13］首次报道了单增李斯特菌对青霉素(Penicillin G and Ampicillin)的耐药率为0.6%(2例/351例);到2009年，Davis等［15］检测了90株单增李斯特菌对苯唑青霉素(oxacillin)、头孢曲松(ceftriaxone)和氯林肯青霉素(clindamycin)的耐药率分别为99%、72%和21%。因此有必要对单增李斯特菌耐药机理进行深入研究，为预防和治疗细菌感染提供新的思路和理论依据。

Sigma B(σB)是许多革兰阳性菌对环境胁迫产生应答反应的主要调控因子。研究表明σB因子在细菌产生耐药性方面也具有重要的作用。将枯草芽胞杆菌sigB缺失突变株暴露在利福平中时，它的生长受到抑制，恢复生长的速度也没有野生菌株快［7］。而对于金黄色葡萄球菌，σB更显示出对多种抗生素产生抗性方面都具有重要的作用，如甲氧西林和万古霉素［8，15］。本实验通过检测和比较单增李斯特菌野生菌株EGDe和其σB缺失突变菌株EGDeΔsigB对盘尼西林青霉素、氨苄西林青霉素、利福平、硫酸庆大霉素、四环素盐酸和红霉素6种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)，以及在氨苄西林青霉素、红霉素和利福平中的生长活性的差异，探索σB与单增李斯特菌耐受抗生素作用的关系。本研究结果显示:σB编码基因sigB的缺失降低了突变株EGDeΔsigB对盘尼西林青霉素、硫酸庆大霉素和四环素盐酸的MIC，以及在氨苄西林青霉素、红霉素和利福平中的生长活性，表明σB不仅仅参与耐受作用于单增李斯特菌细胞壁的抗生素，如盘尼西林青霉素和氨苄西林青霉素，同样也参与调节作用于核糖体、RNA聚合酶、氨酰tRNA与核糖体的结合的抗生素的耐受应答，如红霉素、硫酸庆大霉素、利福平和四环素盐酸。因此，σB在单增李斯特菌耐受多种抗生素作用中均起着重要的作用。那么，σB的具体作用机理是怎样的呢?目前没有相关报道，根据已有的实验证据推测:σB可能参与调控细菌体内与抗生素耐受性相关的基因的表达，从而直接或者间接作用于细菌耐药性的产生。例如:Guinane等［16］发现单增李斯特菌细胞膜至少存在5种青霉素结合蛋白(PBP)，对这些蛋白进行插入失活后，相应突变株对盘尼西林青霉素(penicillin G)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢噻肟(cefotaxime)和头孢呋辛(cefuroxime)4种β-内酰胺类的抗生素的MIC均有不同程度的降低。而这些青霉素结合蛋白的编码基因如lmo0441，在Raengpradub等［17］的全基因组Microarry分析中被证明与σB调控相关。σB如何调节对其他抗生素的耐药应答，需要进一步的研究。

另外，本实验也表明在研究某个(些)基因在抗生素耐受性中的作用时，仅仅只检测和比较标准株和突变株对抗生素的MIC，从而推断目标基因的功能的话，可能会失去一些重要的信息。例如，在本试验中，EGDe和其σB缺失突变菌株EGDeΔsigB对氨苄西林青霉素、红霉素和利福平的MIC一样，但是通过检测2种菌株在这3种抗生素中的生长活性，发现EGDeΔsigB对加入的抗生素更敏感，恢复生长所需时间更长，表明σB在细菌对抗生素产生应答并获得耐药性，解除迟滞过程中也起着重要的调节作用。

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