粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶(ACC)基因的克隆及CT功能域基因的原核表达

李洁琼，王利兵，刘阳，郑世学，喻子牛

(华中农业大学农业微生物学国家重点实验室微生物农药国家工程研究中心，湖北武汉430070)

乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)是催化脂肪酸合成第一步反应的关键酶和限速酶，主要催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酰单酰辅酶A。在大多数原核生物中，该酶属于异质性［1］，由4个单独的亚基组成，分别为生物素羧化酶(biotin carboxylase，BC)、生物素羧基载体蛋白(biotin carboxyl carrier protein，BCCP)和羧基转移酶(carboxyltransferase，α-CT和β-CT)。在ACC催化乙酰辅酶A羧化反应的过程中，BC、CT各催化2个独立的半反应，BCCP作为活化羧基的供体，在BC和CT间传递羧基，反应如下:首先，在ATP供能、Mg2+存在下，BC催化BCCP连上一个活化的羧基，紧接着在CT的作用下将BCCP上的羧基转移到乙酰辅酶A上生成丙二酰单酰辅酶A。在大多数真核生物中该酶由1条带有相应功能域的多肽链编码，即同质型ACC［2］。在油料作物研究中，ACC作为脂肪酸合成的限速酶，成为研究热点。由于高等植物的油脂代谢途径中的同功异构酶、调控因子和遗传操作的复杂性，从高等植物中克隆和鉴定基因要比微生物来源的困难得多，目前在转基因植物中使用的大多数基因均来自微生物，因此从微生物中克隆和鉴定油脂合成和调控的关键基因就成为关注的热点。Meng等［3］从细菌Acinetobacter calcoaceticus中克隆了ACC的4个亚基编码基因并在大肠埃希菌中实现共表达，重组菌株的脂肪酸含量较野生型提高了5.6倍。Ruenwai等［4］成功克隆了真菌Mucor rouxii的ACC基因，将其转化到非油脂酵母Hansenula polymorpha中，总油脂含量提高了40%。粘红酵母(Rhodotorula glutinis)是一种油脂酵母，油脂含量超过70%，其ACC理论上属于同质型，应带有BC、BCCP和CT 3个典型的功能域，其氨基酸序列和基因序列均未在GenBank上检索到。本研究目的是利用分子克隆技术获取粘红酵母ACC的基因序列，以期为转基因油料作物提供新的基因来源。由于在禾本科植物中ACC的CT功能域被证实是几类化学除草剂作用的靶蛋白［5］，而酵母ACCase CT功能域与禾本科植物质体ACCase CT功能域具有较高的同源性，本文将对粘红酵母ACC的CT功能域进行原核表达，希望为进一步探寻CT与除草剂的作用机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒粘红酵母(Rhodotorula glutinis)，编号31596，由中国农业科学院油料作物研究所提供;大肠埃希菌(Escherichia coli)DH5α、表达菌株BL21(DE3)、表达载体pET28a由本实验室保存;质粒载体PMD-18T购自TaKaRa公司。

1.1.2 主要试剂GenomeWalker Universal kit、Ex TaqTMPolymerase、LA TaqTMPolymerase和RNase A、限制性内切酶购自TaKaRa公司，E.Z.N.A.TMYeast RNA Kit和E.Z.N.A.TMYeast DNA Kit购自Omega公司，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit、T4 DNA连接酶购自Fermentas公司，AxyPrepTMDNAGelExtractionKit和AxyPrepTMPCR Cleanup Kit均购自AXYGEN公司，HisTrap FF1毫升柱购自通用电气医疗集团。

1.1.3 培养基粘红酵母采用YPD培养基活化培养，大肠埃希菌采用LB培养基培养，抗性筛选时加入卡那霉素(Kan)，终浓度为50 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 粘红酵母基因组DNA及总RNA的提取

粘红酵母基因组DNA及总RNA的提取方法分别参见Omega公司E.Z.N.A.TMYeast DNA Kit和E.Z.N.A.TMYeast RNA Kit说明书。

1.2.2 简并PCR扩增粘红酵母ACC基因的部分序列［6］在KEGG数据库中下载不同种类酵母和丝状真菌的乙酰辅酶A羧化酶氨基酸序列，进行多序列比对后，选取3个保守区域IANNGIA、QKIIEEA、WGYFSV设计了2对简并引物INF/FY-R、QK-F/WG-R(引物序列见表1)进行PCR扩增。PCR体系如下(50 μL):基因组DNA 1 μL，10×Ex TaqTMbuffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，Ex TaqTM酶0.5 μL(5 U/μL)，ddH2O 37.5 μL。采用降落PCR程序:94℃预变性5 min;其后94℃30 s，51℃45 s，72℃1 min，每经过1个循环温度降低0.5℃，11个循环;然后94℃30 s，46℃45 s，72℃1 min，19个循环;最后72℃延伸10 min。将上述PCR产物分别克隆到载体PMD-18T上，转化DH5α感受态。菌落PCR验证，挑取阳性克隆子进行测序分析。

1.2.3 染色体步移法扩增粘红酵母ACC基因全长［7］保守序列的5'端染色体步移:根据上面获得的部分序列的测序结果设计2条特异性引物GW5-1、GW5-2，结合Genomewalker universal kit中的2条接头引物AP1、AP2，分别组成2对引物GW5-1/AP1、GW5-2/AP2，进行巢式PCR扩增。具体操作如下:①抽提并纯化目标物种的基因组DNA，见OMEGA酵母DNA提取试剂盒说明书;②分别用4种平末端酶(EcoRⅤ、PvuⅡ、DraⅠ、StuⅠ)消化基因组DNA并纯化;③给4种消化好的基因组DNA加上接头Adaptor，构建成Genome walking酶切文库;④以适当稀释的Genome walking文库DNA为模板，用引物AP1和GW5-1进行首轮PCR;⑤再以适当稀释的首轮PCR产物为模板，用引物AP2和GW5-2进行次轮的巢式PCR;⑥琼脂糖电泳回收适当大小的特异性巢式PCR产物，测序验证。

保守序列的3'端染色体步移方法同上。在染色体步移中使用到的引物见表1。

表1 粘红酵母ACC基因克隆工作中使用的引物Table 1 Primers used in the work of ACC gene clone from Rhodotorula glutinis

1.2.4 RT-PCR扩增ACC CT功能域基因参照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit说明书的步骤进行反转录PCR，合成cDNA第一链，再用特异性引物对NH-3-E-F/NH-3-H-R克隆CT cDNA，引物序列如下NH-3-E-F:CG GAATTC CCCGAGTACCCTCGAG;NH-3-H-R:CCC AAGCTT AGCATCCTTCCACACAAG，其中NH-3-E-F带有限制性内切酶EcoRⅠ的识别序列，NH-3-H-R带有限制性内切酶HindⅢ的识别序列，见划线的序列。将扩增得到的目的片段克隆到PMD-18T上转化DH5α感受态，用菌落PCR筛选阳性转化子后送往华大基因有限公司进一步测序验证。

1.2.5 CT功能域基因原核表达载体的构建［8］抽提上述测序验证正确的阳性转化子的质粒PMD-18T-CT，用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切，纯化回收目的片段CT，连接到用相同限制性内切酶进行酶切的pET-28a载体中，连接产物转化DH5α感受态。用同上的方法筛选阳性转化子。

1.2.6 工程菌株目的蛋白的诱导表达及纯化［9］

将验证正确的重组表达载体pET-28a-CT转入BL21(DE3)感受态细胞中，50 μg/mL Kan筛选阳性克隆子，获得含目的基因的工程菌株。工程菌株在LB液体培养基中培养至OD600=0.6时，加入0.1 mmol/L IPTG开始诱导表达。25℃过夜培养16 h，收集菌体。通过SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况。表达获得的粗蛋白用Ni-NTA树脂柱纯化。

2 结果与分析

2.1 粘红酵母ACC基因部分序列的克隆及序列分析

以提取的粘红酵母基因组DNA为模板，利用简并引物QK-F/WG-R及IN-F/FY-R进行PCR扩增，获得2条DNA产物长度分别为500 bp(图1A)、808 bp(图1B)，测序分析正确后将上述获得的2个片段进行序列拼接，得到总长为1 286 bp的DNA序列，命名为NH-IW。

图1 简并PCR扩增粘红酵母ACC基因部分序列的结果Fig.1 The result of cloning partial sequence of ACC gene from Rhodotorula glutinis by degenerate PCR

A:利用引物对QK-F/WG-R进行PCR扩增的结果;B:利用引物对IN-F/FY-R进行PCR扩增的结果;M:DL2000 Marker

A:The result of PCR amplification using primers QK-F/WG-R;B:The result of PCR amplification using primers INF/FY-R;M:DL2000 Marker

将该序列提交到BlastX上进行同源比对，结果显示GenBank上没有登录上述获得的粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因的部分序列。由该序列推导的氨基酸序列与Aspergillus nidulan FGSC A4菌株乙酰辅酶A羧化酶的相似性达到88%。因此证明获得的基因片段为粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因部分序列，可用于下一步的染色体步移实验。

2.2 染色体步移法克隆粘红酵母ACC基因全长

在上述已获得片段NH-IW的基础上，利用染色体步移法扩增获得其5'端序列和3'端序列，凝胶电泳结果如图2所示。通过测序，染色体步移获得的所有片段均是正确的。最终，从DNA水平上拼接获得了总长为7.27 kb的片段。通过生物信息学分析，其中含有2个内含子，分别位于42～147 bp和315～677 bp处，编码区域总长为6 801 bp。在NCBI上对该序列对应的氨基酸序列的保守区域进行分析，发现它具有乙酰辅酶A羧化酶典型的3个功能域BC、BCCP和CT。将该序列提交到BlastX上进行同源比对，结果显示由该序列推导的氨基酸序列与Yarrowia lipolytica YALI0C11407p的乙酰辅酶A羧化酶的相似度到达98%。

图2 序列NH-IW上下游的染色体步移结果Fig.2 The result of genome walking of upstream and downstream of the partial sequence NH-IW

2.3 粘红酵母ACC CT功能域基因的克隆

按照E.Z.N.A.TMYeast RNA Kit说明抽提得到粘红酵母RNA，进行快速琼脂糖凝胶电泳，结果见图3A，28S RNA、18S RNA、5S RNA 3条带均可以看见，测定所得RNA在A260/A280的比值为1.73，说明提取的RNA质量较好。以此RNA为模板，反转录获得cDNA第一链，最后利用特异性引物克隆获得CT功能域的cDNA片段，长度约为1 600 bp，结果见图3B。

2.4 粘红酵母ACC CT功能域基因的原核表达

构建的重组表达载体pET-28a-CT通过测序分析证实重组表达载体中已经插入目的基因，序列正确，且读码框架未发生移码突变。将构建成功的重组载体转入表达菌株中25℃诱导表达，表达产物经过SDS-PAGE分析，与对照相比出现1条与预测蛋白62 ku大小相近的目的条带，表明CT功能域基因成功表达，且表达量较高，见图4A。大量诱导表达重组菌株，收集菌体后超声波破碎，离心收集上清，进行Ni柱纯化后，SDSPAGE电泳检测结果见图4B，纯化后蛋白浓度达到1.8 mg/mL。

图3 粘红酵母总RNA的提取及CT功能域cDNA的扩增Fig.3 Total RNA of Rhodotorula glutinis and amplification of CT cDNA

图4 CT功能域原核表达的SDS-PAGE结果Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expression of CT domain

3 讨论

乙酰辅酶A在不同物种中的分类、定位及基因组织形式存在很大差异［5］，在酵母中ACC为同质型，由一条带有BC、BCCP和CT 3个功能域的多肽链编码，该酶的编码基因在6.5～7 kb之间，且表达丰度不高，使用构建cDNA文库的方法受到反转录酶合成性能的限制，难以合成其全长cDNA序列。本文采用简并PCR和染色体步移法首次克隆获得了粘红酵母ACC基因的全长序列信息。其一，简并PCR成功的关键在于简并引物的设计［6］，应选择保守性强简并度低的氨基酸序列设计简并引物，并且结合目标物种的密码子偏爱性，进一步降低引物简并度，提高简并PCR的特异性。其二，基于PCR技术的染色体步移的方法虽然有很多，包括反向PCR、Tail-PCR、接头PCR［10］、SON-PCR［11］、SEFA-PCR［12］等，但这些方法必须在特殊的PCR条件下进行，往往采用随机引物和巢式PCR，扩增过程中的非特异性产物也没有简便的方法识别［10］。本研究利用Clonetech公司的GenomeWalker Universal kit将接头PCR技术和抑制PCR技术结合起来，防止PCR的非特异性扩增，并且利用降落PCR程序进一步提高PCR扩增的特异性，最终成功获得目的片段。

生物的油脂合成是一个复杂的代谢过程，而乙酰辅酶A羧化酶作为催化脂肪酸第一步反应的关键酶和限速酶，成为转基因油料作物、生物柴油等基因工程研究的重要目标［13］。前人研究证明共表达异质型ACC的4个亚基(BC、BCCP、α-CT和β-CT)或过表达同质型ACC可以一定程度提高宿主的脂肪酸含量［3-4］。但在生物油脂合成这个复杂的代谢网络中，油脂代谢是由多基因协同控制的，对单基因进行表达调控实现大幅度提高油脂含量难度较大，而且油脂合成还与其他代谢网络密切相关，因此在整个过程中可能存在反馈抑制作用。例如，磷脂的合成和脂肪酸的合成就是共调节的，当磷脂合成速率低于脂肪酸合成的速率时，由此导致的酰基-酰基载体蛋白(acyl-ACPs)的累积会反馈抑制ACC［14］。上述因素都是后续工作中需要考虑的问题。

在植物中质体ACC控制着脂肪酸的合成。双子叶植物质体ACC为异质型而禾本科植物质体ACC为同质型，针对这一点可以设计杂草敏感而对其他作物无影响的特异性除草剂［5］。Zhang等［15］通过对酵母CT晶体结构的研究阐明了除草剂是通过与CT功能域相互作用来抑制ACC的分子机制。随着除草剂的广泛使用，出现了很多抗性杂草，因此需要设计和筛选更多新型除草剂。本研究克隆和表达了粘红酵母ACC的CT功能域基因，为设计新型除草剂及其机理研究提供了有价值的材料。

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