我院临床分离的26株铜绿假单胞菌耐药性及其所产β-内酰胺酶的基因型分析Δ

王 杨，高 辉，黄云昆，付晓野，徐 敏（昆明市延安医院检验科，昆明市 650051）

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）广泛分布于自然界，属于条件致病菌，在正常人体内很少致病，却是医院感染的重要病原菌之一。随着新型广谱抗菌药物的广泛应用，PA对β-内酰胺类抗菌药物的耐药性日益严重，限制了抗菌药物的选择，给临床抗感染治疗带来了极大的困扰。本研究收集我院临床标本中分离的26株PA，通过研究其所产β-内酰胺酶的基因型及耐药性特点，为进一步研究昆明地区PA耐药基因的分布情况奠定基础，为减少耐药PA的产生、提高临床抗感染治疗效果提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

VITEK32型全自动细菌鉴定仪（法国生物梅里埃公司）；聚合酶链反应（PCR）仪（德国Biometra公司）；PowerPac Basic电泳仪和Laboratovies 6000凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2 菌株

2009年6月－2009年12月我院检验科临床标本中分离的非重复性PA26株；质控菌：大肠埃希菌（ATCC25922）和铜绿假单胞菌（ATCC27853）均由云南省临检中心提供。

1.3 试药

药敏试验用M-H培养基和亚胺培南、环丙沙星药敏纸片均为英国Oxoid公司产品；哌拉西林、氨曲南、头孢他啶、头孢哌酮、头孢吡肟、替卡西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、庆大霉素、阿米卡星、奈替米星、妥布霉素、复方磺胺甲唑（复方新诺明）、左旋氧氟沙星药敏纸片均为北京天坛药物生物技术开发公司产品；细菌基因组提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）；基因扩增试剂盒（Taq PCR MasterMix）（北京博迈德科技发展有限公司）；PCR扩增引物（北京百泰克生物技术有限公司合成）。

2 方法

2.1 细菌鉴定与药敏试验

细菌鉴定采用全自动细菌鉴定仪进行鉴定。药敏试验采用琼脂纸片扩散（Kirby-Bauer）法检测细菌对我院16种常用的抗菌药物（亚胺培南、环丙沙星、哌拉西林、氨曲南、头孢他啶、头孢哌酮、头孢吡肟、替卡西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、庆大霉素、阿米卡星、奈替米星、妥布霉素、复方磺胺甲唑（复方新诺明）、左旋氧氟沙星药敏纸片）的耐药性。具体方法：用接种环挑取菌落制备成0.5 cfu·mL－1的菌液均匀涂布于药敏试验用M-H平板上，再贴上对应抗菌药物的药敏纸片（每张纸片间距不少于24 mm，纸片中心距平板边缘不少于15 mm），置于35℃温箱内孵育18～24 h，按2008年版美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）的标准根据抑菌圈的直径大小来判定菌株对该抗菌药物的耐药率、中介率和敏感率。

2.2 提取细菌基因组DNA

用细菌基因组提取试剂盒提取细菌DNA作为模板，按试剂盒说明书操作。

2.3 基因检测

用PCR仪扩增7种β-内酰胺酶基因，7种靶基因引物序列见表1[1]。

表1 PCR引物序列表Tab 1 PCR primer

PCR扩增体系均为：Taq PCR Master Mix溶液25 μL，模板0.5 μL，P1 引物2 μL，P2引物 2 μL，无菌去离子水补足至50 μL。热循环参数均为：94℃、2 min，然后94℃、60 s→55℃、60 s→72℃、60 s，循环35个周期，最后72℃、10 min。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色，与DNA分子量标准进行比较，凝胶成像系统观察是否有表1中相同产物长度的产物。

2.4 基因序列测定与分析

β-内酰胺酶基因扩增的阳性产物经纯化后，送北京博迈德科技发展有限公司用ABI 377型全自动DNA序列分析仪进行序列测定，所测序列参照美国国立生物技术信息中心（NCBI）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）的GenBank DNA序列数据库进行序列比对和同源性分析。

3 结果

3.1 细菌鉴定结果

结果表明，我院检验科临床标本中分离的26株细菌均为PA。

3.2 药敏试验结果

26株PA对16种抗菌药物的耐药性，见表2。

由表2可知，除庆大霉素、阿米卡星、奈替米星、妥布霉素以外，26株PA对12种常用抗菌药物有不同程度的耐药性。

表2 26株PA对16种抗菌药物的耐药性分析结果Tab 2 Drug-resistant rate of 26 strains of PA to 16 kinds of antimicrobial drugs

3.3 β-内酰胺酶基因PCR检测结果

26株PA均检测出TEM基因，其中5株PA的基因扩增产物的电泳图见图1。而SHV、OXA、PER、VEB、GES、CTX-M-1基因扩增结果均为阴性。

图1 TEM基因扩增产物的电泳图Fig 1 Electrophorogram of TEM gene amplified products

3.4 序列分析及比对

由于诸多原因，本研究仅对6个菌株的TEM基因PCR阳性产物进行了双向测序，共测得523个核苷酸。该序列与Gen-Bank DNA序列数据库里的β-内酰胺酶TEM-1的编码基因同源性为99%，由于6个菌株的结果基本一致，故只选取了1个菌株的测序结果见图2。

4 讨论

PA是医院感染的重要病原菌之一，其对β-内酰胺类抗菌药物的耐药性呈逐年上升趋势，且在各个国家和地区流行的β-内酰胺酶基因型各有不同[2，3]。

图2 某一PA菌株中TEM基因PCR产物测序图Fig 2 DNA sequencing for PCR product of TEM gene of some PAstrain

本研究中的26株PA均检测出TEM-1型β-内酰胺酶基因，与国内其他地区的检测结果有一定差别[4，5]。导致菌株β-内酰胺酶基因携带率不同的原因可能与菌株来源（地理位置）和各地区医院抗菌药物的使用习惯不同有关。TEM-1是革兰阴性菌中最常见的一种广谱β-内酰胺酶，能水解青霉素和低代头孢菌素（如头孢噻吩和头孢噻啶等）。在新一代抗菌药物滥用等因素的影响下，细菌的β-内酰胺酶基因突变，可由广谱酶TEM-1、TEM-2结构序列发生1～5个氨基酸改变而衍生出超广谱β-内酰胺酶，能水解广谱青霉素、第3代头孢类及单环β-内酰胺类抗菌药物。目前已发现了160种TEM型衍生酶，均呈酸性，等电点为5.2～6.5，其中大部分是超广谱β-内酰胺酶[6，7]。药敏结果显示，本组PA对β-内酰胺类抗菌药物都有不同程度的耐药，尤其对头孢哌酮和氨曲南的耐药率更分别高达73.1%和42.3%。本组26株PA所产β-内酰胺酶可能主要为TEM-1型β-内酰胺酶。而昆明地区PA的β-内酰胺酶基因型除TEM-1型外，是否存在其他基因型，其流行率如何，本课题组正在进行深入研究。

此外，药敏试验显示，该组PA不仅对β-内酰胺类药物耐药，对β-内酰胺酶抑制剂、碳青霉烯类、磺胺类和喹诺酮类等其他抗菌药物也存在很高的耐药率。PA表现为多重耐药，其机制非常复杂，研究[8]发现细菌可通过基因变异或基因水平转移获得耐药基因，除产生各种β-内酰胺酶外，还可产生抗菌药物修饰酶、外排泵高表达、药物作用靶位改变和外膜通透性改变等。

PA对同一种类抗菌药物的耐药通常不是由单一因素造成的，而是几种机制协同作用的结果，其对不同种类抗菌药物的耐药机制也各有不同，还不断有新的耐药机制出现，而且同一菌种在不同地区、不同时期其耐药性和耐药基因的携带状况也不尽相同[8，9]。因此，检测当地PA的耐药率及耐药基因流行情况，对于及时发现突变株、指导临床合理使用抗菌药物、预防和控制感染具有重要意义。

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