半滑舌鳎雌性特异fosmid克隆的筛选及FISH定位＊

翟 腾，王旭波，王 晶，高金宁，翟介明，张全启＊＊

（1.中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室，山东青岛266003；2.莱州明波水产有限公司，山东莱州261418）

半滑舌鳎雌性特异fosmid克隆的筛选及FISH定位＊

翟 腾1，王旭波1，王 晶1，高金宁1，翟介明2，张全启1＊＊

（1.中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室，山东青岛266003；2.莱州明波水产有限公司，山东莱州261418）

通过对半滑舌鳎雌鱼fosmid文库进行有序混合，成功构建了两步－三维PCR筛选体系，为后续的基因筛选奠定了基础。通过对半滑舌鳎W染色体文库序列进行引物设计，并分别在雌、雄鱼基因组DNA中筛选，获得1对雌鱼特异性引物。使用该引物对fosmid文库进行筛选，得到1个雌鱼特异性克隆，并通过荧光原位杂交技术将克隆定位到了W性染色体上，证实了使用该体系进行文库筛选的有效性以及雌鱼引物的特异性，建立了半滑舌鳎遗传性别的分子及细胞遗传学鉴定方法，为后续半滑舌鳎基因组及性染色体的研究奠定了基础。

半滑舌鳎；fosmid文库；超级池；荧光原位杂交

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）属鲽形目（Pleuronectiformes），舌鳎科（Cynoglossidae），舌鳎属（Cynoglossus），为近海冷温底栖性鱼类，因其营养丰富、味道鲜美、出肉率高等特性深受消费者喜爱［1］，并已实现工厂化全人工养殖。随着基因组学相关技术的飞速发展，对于半滑舌鳎基因组的相关研究也逐渐深入，目前已经利用各种载体构建了半滑舌鳎的全基因组文库，如Shao等［2］构建了半滑舌鳎的BAC文库，孙晓华等［3］构建了雌鱼fosmid基因组文库并进行了序列分析等。基因组文库的构建可以极大方便基因、基因组、染色体组的研究工作。通过对文库进行有序混合，构建文库两步－三维PCR筛选系统，可以实现文库的准确高效筛选，对于物理作图、图位克隆、分子标记发掘及染色体定位等工作有重要作用。

半滑舌鳎具有雌、雄个体差异巨大的特性，雌性个体生长速度比雄性快2～3倍，成熟雌鱼全长可达雄鱼的2倍以上，体质量可达雄鱼的10倍［4］。因此，通过对半滑舌鳎性别决定和性腺分化等进行研究，并开展全雌育种，可以极大地提高半滑舌鳎的养殖效益。目前，关于半滑舌鳎性别决定的研究也取得一定进展，周丽青等通过染色体分析，查明了半滑舌鳎性别决定为ZW型，雌性个体有1个较大的W染色体［5］；邓思平等［6］对性腺分化及温度对性别决定的影响的研究，陈松林等［7］获得了雌鱼特异性AFLP分子标记，本研究室的Wang等［8］对其W性染色体进行了显微切割分离并构建了W性染色体DNA文库。

快速鉴定半滑舌鳎的遗传性别是进行全雌育苗的重要任务之一，在过去研究中，通过染色体显微切割技术，已构建了半滑舌鳎W性染色体特异文库，因此，从已有文库序列中筛选获得雌鱼特异性引物是进行雌雄鉴别的1个可行方法。获得的雌鱼特异性引物可通过三维PCR文库筛选系统定位到fosmid文库中，然后利用染色体荧光原位杂交技术（Florescence in situ hybridization，FISH）将文库中的雌鱼特异性DNA片段定位到半滑舌鳎的染色体上，从而有效、直观地验证所得到的雌鱼引物的特异性。

本研究通过筛选半滑舌鳎W染色体文库，获得雌鱼特异性引物，同时利用三维PCR筛选系统，在已构建的fosmid文库中筛选出含有雌性特异片段的阳性克隆，并通过荧光原位杂交将该克隆定位到半滑舌鳎的W染色体上，证实了文库筛选的有效性、证明了所筛选W染色体引物的特异性，同时为半滑舌鳎遗传性别的鉴定提供了新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

建库用实验材料为已建成的fosmid文库第1～200号板，共19 200个单克隆。

荧光原位杂交所需半滑舌鳎雌鱼取自山东近海（36°26′N，121°21′E）。

1.2 试剂

LB液体培养基，氯霉素，甘油，20×SSC，10%硫酸葡聚糖，TWEEN20，RNase A，生物素－切口平移探针标记试剂盒，Avidin－Fluorescein，PI。

1.3 方法

1.3.1 超级池的构建及质粒的提取 超级池的构建方法具体参照Zhang等［9］的实施方案。选取fosmid文库中的200个96孔板，以每20个板为1组构建超级池，一共构建10个超级池。每个超级池含菌1 920个，全部超级池共含菌19 200个。使用常规碱裂解法提取超级池及其二级池的质粒DNA，超纯水溶解后4℃保存。

1.3.2 半滑舌鳎雌鱼特异性引物的筛选 本研究室已经在前期的工作中建立了染色体的显微切割技术，并利用切割获得的半滑舌鳎W染色体的DNA，构建了半滑舌鳎W染色体特异文库，分析获得了文库部分克隆的序列［8］，从该文库中选取240条W染色体序列，使用Primer Premier（version 5.0）软件设计引物，共得到引物210对，由博尚公司进行引物序列合成。使用梯度PCR仪（Bio－Red）确定各对引物的最适退火温度，然后分别以半滑舌鳎雌、雄鱼基因组DNA为模板进行PCR筛选，PCR反应程序为94℃30 s，最适退火温度30 s，72℃30 s，共25个循环，以期获得雌鱼的特异性引物。

1.3.3 雌鱼特异性引物在fosmid文库中的定位 以10个超级池的fosmid质粒为模板，利用筛选出的半滑舌鳎雌鱼特异性引物对其进行PCR筛选，退火温度、PCR条件均为各引物的最适条件。对有阳性反应的超级池进行行池、列池、板池的2次筛选，从而确定该阳性克隆所在的位置。

1.3.4 阳性克隆的荧光原位杂交 阳性克隆的质粒提取步骤同1.3.1，荧光原位杂交具体步骤参考Wang等［8］的方法。

2 结果

2.1 超级池的构建

构建得到10个超级池。每个超级池下含35个二级池，即：8个行池、7个列池及20个板池。整个文库由10个超级池和350个二级池组成。

2.2 半滑舌鳎雌鱼特异性引物的筛选

210对引物经过PCR筛选后，得到1对雌鱼特异性的引物WS01（F：ACCTGTCAACCAGCAAAT；R：ACAGTGAAACAGCAGGGA）。该引物扩增产物长度为239bp。将半滑舌鳎雌、雄各10尾分别提取肌肉DNA作为模板，利用该引物进行PCR扩增，结果如图1所示，仅在雌鱼中有扩增条带，表明筛选出的引物是半滑舌鳎雌性特异引物，可以用来鉴别半滑舌鳎的遗传性别。

图1 W染色体特异性引物WS01在半滑舌鳎雌、雄个体中的扩增结果Fig.1 PCR amplification results of the female－specific primer（WS01）t in female（♀）and male（♂）genomic DNA.M：DL2000 ladder

2.3 fosmid阳性克隆的筛选

使用半滑舌鳎雌鱼特异性引物对超级池进行PCR筛选，结果见图2A，在10个超级池中第三超级池有阳性信号。对第三超级池（041－060号板）进行第2次筛选，结果见图2B、C，可见在H行池、列池3－1、列池4－1及第41号板有阳性信号，而列池3－1与列池4－1的交集为列池1，表示该克隆位于第41号96孔板的H－1孔中。

图2 WS01在10个超级池中的筛选结果Fig.2 Superpools’screening result with female－specific primer（WS01）

2.4 阳性克隆的荧光原位杂交结果

将筛选出的含有雌性特异片段的f克隆提取质粒并做成探针，经C0t－1 DNA封阻后，对半滑舌鳎雌鱼染色体分裂相进行荧光原位杂交，结果见图3。在观察到的所有分裂相中均出现1个杂交信号，该信号位于W染色体的中部（箭头所示）。

图3 A041H1克隆在半滑舌鳎雌鱼染色体上的定位Fig.3 FISH localization of female－specific fosmid clone A041H1 on metaphase chromosome of female C.semilaevis

3 讨论

基因组研究特别是物理图谱的构建有3个决定性的环节：连锁图的精细度、基因组文库的质量和文库的筛选效率和准确性［10－11］，其中第3个因素是制约整个基因组研究效率的瓶颈，直接影响到后续研究的进展和可靠性［12－14］。文库的筛选分为三维PCR筛选法和杂交筛选法。杂交法使用同位素进行探针标记，敏感度高但受放射性危害和半衰期短等的限制［15］。PCR筛选法操作简单，具有快速、经济、灵敏度高，建成超级池后工作量小等优点，因此本实验选用三维PCR筛选法对半滑舌鳎雌鱼fosmid文库进行筛选。在对雌鱼特异性引物的文库筛选中可以看出，在构建超级池后，只需要2步共45个PCR反应｛10（超级池数）＋8（行池数）＋7（列池数）＋20（板池数）＝45个PCR反应｝，即可从19 200个克隆中准确找到目的克隆，可见此三维PCR筛选法效率之高。三维PCR筛选不仅可以迅速有效的筛选到大量功能基因用于基因组研究，还可以结合fosmid质粒末端测序、FISH、染色体步移等技术构建重叠群contigs，并将相关基因定位到染色体上，同时还对物理图谱的构建以及基因在图谱上的定位有着重要的贡献。

半滑舌鳎雌鱼特异性引物的获得对于进一步开展其性别决定机制研究具有重要意义，同时，对开展全雌品种培育也具有重要意义。半滑舌鳎的性别为ZW型决定方式［5］，且雌、雄个体差异非常大，雌性个体生长速度是雄性的2～3倍，成熟雌鱼全长可达雄鱼的2倍以上，体质量可达雄鱼的10倍，如此大的两性差异在其他鱼类中少有［4］。目前半滑舌鳎已实现工厂化全人工养殖。因此如何快速确定及选育半滑舌鳎雌鱼成为大规模养殖中创造效益的关键，全雌育苗也成为半滑舌鳎养殖中的重大技术课题。实现全雌育苗的重要途经之一是通过伪雄（生理上为雄性但遗传上为雌性）与正常雌鱼交配获得超雌个体，然后由超雌个体培育全雌后代，而伪雄鱼则可通过人工诱导雌鱼性逆转获得，因此，如何从雄鱼群体中识别伪雄鱼个体，或者说如何简单地区别遗传上的雌鱼和雄鱼，是开展全雌育种的关键之一。不难看出，在筛选到半滑舌鳎雌性特异引物后，只需1次PCR反应即可方便的鉴定半滑舌鳎的遗传性别，可用于筛选半滑舌鳎伪雄鱼，同时对于伪雄与雌鱼交配后代的检验也能起到重要的作用，从而促进半滑舌鳎全雌育种的发展。同时，通过对fosmid文库进行三维PCR筛选得到的半滑舌鳎W染色体特异性的阳性克隆的方法，为半滑舌鳎性染色体基因组研究、性别相关的基因研究、性染色体的进化等提供了重要的方法参考。

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Screening and FISH Locating of a Female－Specific Fosmid Clone of Half－Smooth Tongue Sole

ZHAI Teng1，WANG Xu－Bo1，WANG Jing1，Gao Jin－Ning1，ZHAI Jie－Ming2，ZHANG Quan－Qi1
（1.The Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding，Ministry of Education，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.Mingbo Aquatic.Com，Laizhou 261418，China）

A 2－step－3D－PCR screening system of the female half－smooth tongue sole fosmid library was successfully constructed by a orderly mixing of the fosmid clones.By priming and screening W－chromosome library of half－smooth tongue sole，one pair of female－specific primers were obtained.Using the female－specific primers，a W－chromosome DNA fragment was located in the fosmid library and assigned to W－chromosome using florescence in situ hybridization（FISH），which proved the exclusivity of the primers and provided a conformation on the efficiency of the 2－step－3D－PCR screening system.The female－specific primers could be of good use in pseudo－male detection of half－smooth tongue sole.This study provides a base for further genetic analysis in this species and will be important for a better understanding of the C.semilaevis W chromosome.

half－smooth tongue sole；fosmid library；super pool；florescence in situ hybridization

Q959.486

A

1672－5174（2011）11－057－04

国家高技术研究发展计划项目（2006AA10A404）；山东省泰山学者建设工程专项资助

2011－04－08；

2011－05－16

翟 腾（1985－），男，硕士生，从事鱼类遗传育种研究。E－mail：cr－sh123＠163.com

＊＊通讯作者：E－mail：qzhang＠ouc.edu.cn

责任编辑 朱宝象